慢性肝损伤家兔胆石症模型制作及成石因素研究
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[摘要]目的：建立四氯化碳(CCl4)所致慢性肝损伤、肝硬化大耳白兔模型，在此基础上研究CCl4所致慢性肝损伤的胆囊结石情况，探讨慢性肝损伤家兔胆囊结石形成的机制，从而论证采用慢性肝损伤家兔建立胆石症模型的可行性。方法：将50只家兔随机分成正常组、高胆固醇膳食组、慢性肝损伤组、肝硬化组、肝损伤后胆固醇组。观察家兔的胆石形成情况，透射电镜观察肝细胞超微结构，抽取胆汁细菌培养，酶比色法检测胆囊胆汁中胆汁酸、胆固醇的含量。结果：正常组无一例成石，高胆固醇膳食组8/8成石，慢性肝损伤组5/8成石，肝硬化组6/7成石，肝损伤胆固醇组6/8成石。慢性肝损伤组、肝硬化组、高胆固醇膳食组、肝损伤胆固醇组4组中肝脏超微结构均发生不同程度异常改变，以肝细胞水肿变性、核膜呈锯齿状、粗面内质网增多、线粒体肿胀为多见，肝硬化家兔组可见肝细胞凋亡坏死，高胆固醇膳食组可见胞质中大量脂滴。各组细菌培养均未发现细菌生长。慢性肝损伤组、肝硬化组胆囊胆汁中胆汁酸、胆固醇的含量均较正常组降低。结论：皮下注射CCl4致家兔肝损伤，进而诱导胆囊结石的造模方法可靠。形成的结石为混合性结石。慢性肝病所致肝细胞超微结构异常引起胆汁成分的改变，是肝病患者易发生胆石症的主要原因。慢性肝损伤、肝硬化与胆石症的发生有密切关系，且随着肝脏病变的加重，成石率升高。细菌感染可能不是慢性肝损伤胆囊结石的独立致石因素。
[关键词]慢性肝损伤；胆石症；肝细胞超微结构；动物模型
[中图分类号]R575 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2007)12(a)-106-04
近年，肝硬化后所引起的胆囊结石再次受到国内外学者的普遍关注。关于肝硬化合并胆囊结石的报道屡见不鲜，通过尸检、B超检查和临床资料回顾，国内肝硬化合并胆囊结石发病率为15.1％～59.0％，其发病率至少为非肝硬化病人的两倍。有学者认为胆囊结石病伴随的肝脏损害，很可能是胆囊结石的成因，而不是后果，也许它先于胆囊结石而存在。而胆囊结石病的反复发作，反过来加重原发性肝损害。现对四氯化碳(CCl4)诱导的慢性肝损伤兔模型进行研究，报道如下：
1 材料与方法
1．1 实验动物分组与处理
健康成年大耳白兔50只，体重2.5～3.0 kg，雌雄不拘，由广西中医学院实验中心提供。购入后适应性喂养1周，后随机分为5组，即正常组10只，终未存活10只，投以普通饲料10周，并予皮下注射生理盐水(2ml/kg，每4天1次，连续10周)。高胆固醇膳食组10只，终末存活8只，投以高胆固醇饲料(含1.8％胆固醇，胆固醇购于上海同药集团)lO周。慢性肝损伤组10只，终末存活8只，投以普通饲料，将CCl4(购于上海国药集团)与花生油以1:2.5比例混合，制成40％CCl4溶液，家兔称重后以2ml/kg体重，颈后皮下注射CCl4溶液，每4天1次，以形成皮下丘状突起为宜，连续10周，以肝脏病理检查纤维组织增生，肝细胞水肿、局部气球样变，但未形成假小叶为造模成功。肝硬化组10只，终末存活7只，投以普通饲料并予皮下注射CCl4(2ml/kg，每4天1次，连续20周)，以肝脏病理检查假小叶形成为造模成功。肝损伤胆固醇组10只，终末存活8只，在慢性肝损伤的基础上投以高胆固醇饲料10周。
1．2 实验项目
动物禁食(不禁水)24h。20％氨基甲酸乙酯(1g/kg)耳缘静脉注射麻醉，碘伏消毒后开腹，结扎胆囊颈部后摘除胆囊，先肉眼观察成石情况，并用注射器抽取全部胆汁至无菌试管，以日本东芝120自动生化分析仪对胆汁进行胆固醇、胆汁酸分析；部分胆汁进行细菌培养。于肝脏表面滴电镜固定液后切取约1mm3，放人4℃预冷的电镜固定液中保存，日立H～500透射电镜观察粗、滑面内质网，高尔基复合体，核糖体，线粒体等。另切取1cm3的肝组织于4％福尔马林液中，经常规脱水，石蜡包埋，切5tμm厚切片，常规苏木精伊红染色，光镜下观察。
1．3 统计学方法
采用SPSS 14.0进行统计学处理。
2 结果
2．1 各组动物胆囊结石情况
经鉴定，高胆固醇膳食组形成胆固醇结石，其他3组形成以胆红素为主的混合性结石(表1)。
2．2 各组动物胆囊胆汁胆固醇、胆汁酸水平见表2。
2．3 肝脏病理结构及超微结构
高胆固醇膳食组见肝细胞排列紊乱，肝细胞浊肿，局部发生脂肪变，并可见小胆管瘀胆、棕黄色，汇管区胆管增生、瘀胆、结蒂组织增生、汇管区见有炎性细胞浸润，慢性肝损伤组见纤维组织增生，肝细胞水肿、局部气球样变、胆管增生、少许淋巴细胞浸润，汇管纤维间隔稍增宽。肝硬化组见假小叶形成，小叶内中央静脉缺如，细胞排列紊乱，多数细胞水肿，局部气球样变，小胆管增生、伴有淋巴细胞浸润。肝损伤后胆固醇组见肝细胞排列紊乱，染色较深。细胞形态正常，汇管血管扩张明显，小胆管大量增生、淋巴细胞浸润，少量纤维结缔组织增生，但无假小叶形成。电镜下慢性肝损伤组、肝硬化组、高胆固醇膳食组、肝损伤胆固醇组四组中肝脏超微结构均发生不同程度异常改变，以肝细胞水肿变性、核膜呈锯齿状、粗面内质网增多、线粒体肿胀为多见，肝硬化家兔组可见肝细胞凋亡坏死，高胆固醇膳食组可见胞质中大量脂滴(图1～5)。
2．4 胆囊胆汁细菌培养
各组动物胆囊胆汁细菌培养都未发现细菌生长。
3 讨论
3．1 四氯化碳皮下注射致家兔肝损伤诱导胆囊结石模型的建立
四氯化碳又称四氯甲烷，临床研究表明，四氯化碳是引起人类肝损害的剧毒类化学药物。CCl4所致肝损伤的机制为CCl4进入机体后产生的自由基，造成细胞膜脂质过氧化，致使细胞膜结构和功能遭受到破坏，从而引起细胞中毒死亡。这与肝炎所致的类似反应与免疫损伤所造成的肝细胞水肿、变性相类似。一系列的动物研究证明,四氯化碳除致急性肝损伤外，反复多次的刺激可导致慢性肝损伤的发生，而后者主要表面为肝细胞再生和纤维化。随着染毒时间和次数的增加，肝脏坏死程度逐渐加重可致肝硬化的发生。故我们选择以家兔为对象，参照金博等围入的方法并加以改进建立慢性肝损伤及肝硬化动物模型，在此基础上可诱发胆囊结石。实验结果证明，CCl4致肝损伤家兔胆囊结石形成率高，成石时间较短，约10周肝损伤组可形成肉眼可见结石。动物易饲养，造模价格便宜，因此为肝损伤合并胆石症的深入研究提供了有力的工具。
3．2 不同情况下胆囊胆汁胆结石形成特点
实验中发现慢性肝损伤组家兔胆囊几乎均为针尖样胆沙，而随着造模时间的延长，肝硬化组家兔胆囊中出现1mm左右大小的结石，光镜观察不同于高胆固醇膳食组的胆固醇结晶，并且能溶于NaOH溶液，形成的结石多为胆红素结石与混合性结石。结合对其胆汁成分的分析，我们发现胆固醇组胆汁中的胆固醇含量显著高于正常对照组(P＜0.05)，慢性肝损伤组与肝损伤胆固醇组与正常组没有明显差异，肝硬化组胆固醇含量低于正常组，而肝损伤胆固醇组有血清胆固醇明显增高，但胆汁中总胆固醇变化不明显，且随着肝损伤严重，胆囊胆汁酸下降。
3．3 肝超微结构病理变化与胆结石
胆结石伴有肝脏的组织学改变具有普遍性，特别是胆管结石，可引起不同程度的肝脏损害，此已被众多的学者所认同。有学者认为胆囊结石病伴随的肝脏损害，很可能是胆囊结石的成因，而不是后果，也许它先于胆囊结石而存在，而胆囊结石病的反复发作，反过来加重原发性肝损害，Apstein进一步提出肝细胞合成分泌胆汁机制受损有可能是胆囊结石患者所存在的一系列肝胆道病理状态的启动扳机，而肝脏的损害首先就表现在肝细胞的超微结构的改变上。我们的实验发现各模型组家兔的肝脏超微结构都发生了不同程度的改变，虽然不同处理因素家兔组肝脏超微结构改变有自己的特点，但都存在有不同程度的膜破裂，质浆中的粗面内质网和高尔基复合体水肿、变性，线粒体坏死，双层模结构消失，部分有空泡样变，滑面内质网减少，粗面内质网部分断裂，颗粒减少，溶酶体增加，肝细胞边界模糊不清，细胞质电子密度减少等各种相应结构改变。肝硬化组表现尤其明显，这也与各组的肝功能的改变相一致(另文报道)。在肝细胞内与胆汁分泌密切相关的主要有滑面内质网(SER)、高尔基复合体(GC)以及粗面内质网(REP)。由于参与胆固醇合成和转化的酶主要分布在肝细胞的滑面内质网上，所以胆固醇的合成以及由胆固醇转化成胆汁酸大都在内质网中进行，而胆固醇和胆汁酸正是胆汁的主要成分。胆汁的排泌则是由高尔基复合体参与。以运输小泡的形式将胆汁排人毛细胆管。其中滑面内质网还参与脂类代谢，激素代谢和生物转化等功能，特别是通过自身的葡萄糖醛酸转移酶将不溶于水的胆红素转变为水溶性的结合胆红素，从而使胆红素更方便地排入毛细胆管，参与胆汁的形成。肝细胞不仅分解代谢，而且还参与蛋白合成，主要在粗面内质网进行，参与合成的有白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原及各种载体蛋白。而合成的蛋白均通过高尔基复合体排泌入窦周隙，再人肝血窦。因此肝组织超微结构的变化与胆结石形成密切相关。
4 慢性肝损伤与胆结石形成之间的关系
我们的实验资料显示，肝硬化家兔胆囊结石发生率为86％，慢性肝损伤组胆囊结石发生率为50％，高胆固醇膳食组为100％，而正常对照组为0。前两者与正常组比较均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。肝硬化组与慢性肝损组比较，胆囊结石阳性检出率没有明显差异，但肝硬化组胆囊胆汁可见有形成分较慢性肝损组明显居多，且后者胆汁中以胆泥为主，尽管并不是所有的胆泥将导致胆石症，但大量实验证明胆泥形成是胆石形成的必经阶段。在结石形成过程中，一方面慢性肝损伤时胆汁代谢紊乱，胆汁酸和胆盐减少，对胆固醇的溶解度降低，胆汁中的胆固醇就超饱和并随后析出单水胆固醇结晶，接着这些结晶聚集到被黏蛋白覆盖的胆囊黏膜上开始成核和成石的过程，从而易形成胆固醇结石。另一方面慢性肝损伤通过以下机制导致色素类结石形成：肝硬化时肝细胞受损，不能有效地摄取门静脉重吸收的胆汁酸，以及门静脉高压、门体分流，胆汁酸反流人血，使血中胆汁酸浓度升高。当血清TBA含量升高，则反馈抑制肝细胞内质网7a-羟化酶的活性，使肝细胞将胆固醇转化为胆汁酸能力下降，从而肝脏分泌进入胆汁的胆汁酸含量减少，使胆固醇和胆红素的溶解度降低，在成核因子共同作用下形成胆固醇结石和胆红素结石。但在慢性肝损伤状态下胆石的成因机制中，胆色素类结石的形成机制似乎更显重要。
有临床研究表明肝硬变状态下，易于导致细菌感染，细菌感染时产生的β－葡萄糖醛酸苷酶，可使水溶性的胆红素二葡萄糖醛酸酯水解为非结合胆红素，而在溶解度上存在非结合胆红素＜单葡萄糖醛酸酯＜双葡萄糖醛酸酯，同样有利于色素类结石的形成。但在我们的动物实验中，未发现胆囊胆汁中存在细菌感染，考虑为临床肝硬化多见于乙型病毒性肝炎感染后，且与肝脏慢性损伤时间较长，机体免疫功能低下，使肝脏细菌清除能力降低，同时脾功能亢进及门体静脉之间侧支循环的建立，增加了病原微生物侵入体循环的机会，易于并发各种感染。因此我们考虑在慢性肝损伤疾病中细菌感染可能不是导致易发胆囊结石的独立致石因素。但细菌感染可以增加结石生成率。