PD―L1抑制同种淋巴细胞增殖反应研究
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【摘 要】目前已证实I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有关，自身反应性T细胞在I型糖尿病的免疫发病机理中起主导作用。pd-l1已被证实为免疫负性调节受体PD-1的配体，文献证明PD-L1在免疫负性调节及外周耐受中发挥重要作用。本实验在前期构建PD-L1表达载体和初步研究其功能的基础上，进一步研究PD-L1对同种淋巴细胞的负性调节作用，通过建立稳定表达PD-L1胰岛细胞株，观察PD-L1对同种淋巴细胞增殖的影响。
【关键词】I型糖尿病；PD-L1；NIT-1细胞
目前已证实I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有关，自身反应性T细胞在I型糖尿病的免疫发病机理中起主导作用[1]。移植胰岛细胞治疗I型糖尿病是一个具有前景的治疗策略，然而自身反应性T细胞的存在是胰岛移植治疗I型糖尿病方法中最大的障碍。程序性死亡分子配体-1（PD-L1）和程序性死亡分子配体-2（PD-L2）已被证实为PD-1的配体[2]。由于PD-L1在非淋巴组织的表达提示PD-L1可以调节自身反应性T细胞或B细胞，同时（或者）调节靶器官的炎症反应。有研究表明，PD-L1信号可以介导T细胞的凋亡，在肿瘤细胞逃逸免疫系统攻击中起重要的作用。通过抗体阻断PD-1：PD-L1这条通路可促进NOD鼠糖尿病的发生和发展[3]。本实验在前期构建PD-L1表达载体和初步研究其功能的基础上，进一步研究PD-L1对同种淋巴细胞的负性调节作用，通过建立稳定表达PD-L1胰岛细胞株，观察PD-L1对同种淋巴细胞增殖的影响，为PD-L1修饰胰岛细胞移植重建糖尿病患者胰岛细胞功能研究提供新的策略。
1 材料
NIT-1细胞株（小鼠胰岛β细胞株）由澳大利亚WEH1实验室惠赠，本室传代培养与保种。pEGFP-N1-PD-L1 质粒含有表达绿色荧光蛋白（EGFP）基因序列，由本科室构建。阳离子脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，抗体、CFSE购于美国BD公司。
2 实验方法
2.1 转染PD-L1基因的NIT-1细胞稳定子筛选
根据Lipofectamine2000TM试剂说明书进行。将NIT-1细胞转种于24孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养24h，使细胞达到50～80%的融合；用无血清培养基分别溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂质体，将脂质体与核苷酸混合，室温下静置30min后，在24孔板中加入以上混合液，轻混；培养6h后弃转染液，加入完全培养基，37℃，5%CO2继续培养。流式细胞仪检测GRP78的表达。
2.2 CFSE染色检测PD-L1修饰NIT细胞对同种淋巴细胞增殖影响
将Balb/c小鼠颈椎脱位处死，无菌取脾脏制备成脾淋巴细胞悬液，加入CFSE（ 2μmol/L）染色 ，调整细胞浓度作为同种反应淋巴细胞备用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP细胞，洗涤后用DMEM培养基调节细胞浓度，加入无菌丝裂霉素C（终浓度为30μg/ml），调节细胞浓度作为刺激细胞备用。将Balb/c小鼠脾细胞悬液（反应细胞）分别加入24孔培养板中，每孔5×106个细胞；将刺激细胞分别加入到24孔培养板中，每孔5×105个细胞；实验分组：① NIT- PD-L1+淋巴细胞；②NIT-EGFP+淋巴细胞；③NIT+淋巴细胞。反应细胞和刺激细胞悬液培养7天后FCM测定淋巴细胞增殖。
2.3 统计学分析
采用统计软件SPSS10.0进行方差分析和t检验。
3 实验结果
3.1 稳转NIT-1细胞中EGPF或PD-L1的表达
pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表达载体分别转染NIT-1细胞，培养48h后，经FCM检测EGPF和PD-L1的表达。结果显示：对照组（NIT）EGPF表达率为0，pEGFP-N1转染NIT细胞组EGPF表达率为87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1转染NIT细胞组EGPF表达率为88%±6.8；对照组（NIT）PD-L1表达率为5.4%±0.8，pEGFP-N1转染NIT细胞组PD-L1表达率为4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1转染NIT细胞组PD-L1表达率为90%±5.3（P
CFSE染色流式细胞仪检测结果显示：NIT- PD-L1+淋巴细胞组增殖指数为（4.5±1.6）；NIT-EGFP+淋巴细胞组增殖指数为（9.1±2.1）；NIT+淋巴细胞组增殖指数为（8.5±3.1）。结果说明PD-L1可以抑制同种淋巴细胞增殖，具有统计学意义（P
4 讨论
PD-L1是正性或负性调节T细胞受体（TCR）介导的信号通路B7家族成员之一[4]。一些体内实验研究发现，在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠，体内应用拮抗的单克隆抗体（mAb）阻断B7-H1可以活化效应T细胞，结果促进了自身免疫性糖尿病的发生发展，在半抗原诱导的小鼠接触性过敏反应模型或实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同样促进了自身免疫性疾病的、发生发展[5-6]。以上结果说明，PD-L1在同种免疫应答中的重要负性调节功能。本实验以PD-L1真核表达载体转染NIT-1细胞作为体外细胞模型，研究PD-L1的负性调节功能。从细胞混合培养结果可以看出，PD-L1抑制淋巴细胞的增殖，提示PD-L1抑制反应性淋巴细胞的活化。本实验证明PD-L1对同种免疫应答具有负性调节功能，并初步探讨了其机制，对于诱导并维持免疫耐受具有一定作用。
【参考文献】
[1]Atkinson MA， Kaufman DL， Campbell L， et al. Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J]. Lancet，1992：339，458.
[2]Freeman GJ， Long AJ， Iwai Y， et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J]. J. Exp. Med.， 2000：192，1027.
[3]Ansari MJ， Salama AD， Chitnis T， Smith RN， Yagita H， Akiba H， Yamazaki T， Azuma M， Iwai H， Khoury SJ， Auchincloss H Jr， Sayegh MH.The Programmed Death-1 （PD-1） Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic （NOD） Mice[J]. J Exp Med.， 2003：63，69.
[4]Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2004，4：336-47.
[5]Dong H， Strome SE， Salomao DR et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis： a potential mechanism of immune evasion[J]. Nat Med.， 2002，8：793-800.
[6]Latchman YE， Liang SC， Wu Y et al. PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells， antigen-presenting cells， and host tissues negatively regulates T cells[J]. Proc Natl Acad Sci. USA， 2004，101：10691-6.