甲醛选择性反应探针用于表面增强拉曼散射检测脂多糖

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇甲醛选择性反应探针用于表面增强拉曼散射检测脂多糖范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘 要：构建了一种依赖于表面增强拉曼散射（SERS）技术检测脂多糖氧化产物甲醛，实现对脂多糖的定量检测。在室温条件下，用NaIO4氧化脂多糖生成甲醛，加入巯基拉曼染料4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑（Purpald）与甲醛加合，再加入NaIO4进一步氧化，生成的紫色终产物组装到金纳米颗粒表面，在进行拉曼光谱扫描时产生了SERS增强信号，而在控制实验中没有脂多糖参与时，得到非常弱的SERS信号，由此实现脂多糖的检测。此外，利用紫外可见光谱对脂多糖的氧化产物进行了分析，在540 nm处有甲醛与Purpald加成产物特征的紫外吸收。还对NaIO4、Purpald的反应浓度进行了优化，结果表明，在最优反应条件下，SERS信号随着脂多糖浓度增大而增强，在33～667 mg/L范围内有很好的线性关系，检出限为21 mg/L。本方法无需复杂的实验操作和昂贵的标记试剂。分析速度快，灵敏度高。

关键词：脂多糖； 金纳米颗粒； 表面增强拉曼散射

1 引 言

细菌等微生物的鉴定和检测在发酵工程、医疗实践和环境监测方面都具有重要意义。作为细菌的内毒素，脂多糖（LPS）已经成为诊断革兰氏阴性细菌的重要标志[1，2]。脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁层的主要成分，用于保持细胞外膜的完整性和避免细菌受到外界抗生素的入侵[3]。脂多糖由O-特异性多糖链、核心多糖链和类脂A三部分组成[4，5]。脂多糖可以从细菌的细胞壁上脱落， 释放进入人体，产生免疫反应，引起败血性休克，器官衰竭，严重时甚至导致死亡[6，7]。在美国，每年败血症和败血性休克的患者多达150000[8]。世界范围内，尤其是对于生存环境恶劣和水源不能进行灭菌处理的地区，这个数字仍在上升。因此，脂多糖的分析对相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。目前已经报道的脂多糖检测的方法包括内毒素鲎试剂测定法（Limulus amebocyte lysate，LAL）[9]，气相色谱-质谱分析[10]，电化学分析[11，12]，功能化聚二乙炔脂质体的比色[13]和荧光分析[14]，荧光共振能量转移用于研究荧光基团标记的脂多糖结合肽信标与脂多糖的相互作用[15]，以及基于阳离子的高聚物或者合成化学小分子的分析方法等[16～20]。但是，这些方法或需要繁琐的酶反应，或探针需要标记和复杂的化学合成。

表面增强拉曼散射（SERS）技术因具有高灵敏、高选择性以及适合均相物质结构研究等特点，逐渐在生物学、分析科学、材料科学以及表面科学等方面得到广泛应用[21～24]。由于脂多糖分子中存在邻二醇结构，可被NaIO4氧化生成甲醛，利用醛类反应探针可以实现SERS的化学增强效应。本研究建立了一种依赖于表面增强拉曼散射技术检测脂多糖氧化产物甲醛来实现对脂多糖的定量检测的方法。所用反应活性探针是4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑（Purpald），该探针可以选择性地与甲醛加成[25]，加合产物可以通过巯基自组装到金纳米颗粒（AuNPs）表面，产生增强的SERS信号。与传统方法相比，本方法简单方便、快速、灵敏，且不需要酶反应及复杂的化学合成和标记等优点，且引入了一段较短的亲水性多肽用于金纳米颗粒的表面修饰，提高了金纳米颗粒的稳定性[26]。

2 实验部分

2.1 材料与试剂

大肠杆菌脂多糖（E.coli LPS），由本实验室提取，首先对大肠杆菌菌株进行活化、筛选、扩大培养，然后收集生长旺盛期的细菌，制成细菌悬液。获得的菌液经5000 r/min离心20 min，0.9% NaCl离心洗涤1～2次， 制成浓菌液。用超声波发生器中频（相当于12000 cps）处理20 min。处理液经3000 r/min离心30 min，吸取上清液即为大肠杆菌脂多糖，真空旋干。4-氨基-3-肼基-5-巯基-1，2，4-三氮唑（Purpald，西格玛公司）。亲水性多肽Peptide序列：Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu（上海A′Peptide 公司合成纯化， 纯度>95%）。其它试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

2.2 多肽修饰金纳米颗粒的制备

采用柠檬酸钠还原HAuCl4法制备金纳米颗粒。制备平均粒径为30 nm的金纳米颗粒：200 mL超纯水中加入500 μL 4% （w/w） HAuCl4，搅拌下加热至沸腾后迅速加入2.5 mL 1%（w/w）柠檬酸钠，待溶液颜色不再改变后继续搅拌加热15 min，然后置于室温下冷却，4 ℃保存。使用UV 2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）测得该金溶胶的吸收波长为530 nm，则粒径为30 nm。

取2 mL所制备的AuNPs 10000 r/min离心10 min，用水定容至600 μL，在搅拌的条件下缓慢加入64 μL 0.01 g/LPeptide，用0.2 mol/L NaOH调节pH 6～8，在4 ℃放置过夜。将上述AuNPs-peptide 10000 r/min离心10 min，纯水洗去未标记上Peptide，最后定容至200 mL，所得AuNPs-peptide溶液的浓度为3 nmol/L，放置4 ℃备用。

3 结果与讨论

3.1 基于SERS检测技术用于脂多糖分析的实验设计

利用甲醛选择性反应探针Purpald， 设计了一种新型生物传感器，通过检测脂多糖氧化产物甲醛和Purpald的加合产物，实现对待测物革兰氏阴性细菌的标志分子脂多糖含量的SERS检测，原理如图1所示。文献[27]报道，脂多糖分子中含有多种糖结构，其中庚糖和2-酮基-3-脱氧辛烷（2-keto-3-deoxyoctonate，kdo）分子中含有的邻二醇结构易被NaIO4氧化产生甲醛。脂多糖分子被NaIO4氧化而生成的甲醛与Purpald反应，产物被NaIO4进一步氧化， 生成的紫色终产物， 通过巯基自组装于多肽修饰的金纳米颗粒表面， 产生拉曼增强信号；而在控制实验中，Purpald 自组装到金纳米颗粒表面产生非常弱的拉曼信号。该方法与其它检测方法相比具有很多优点： （1）反应探针Purpald几乎没有背景拉曼信号，它自身可以作为一种非荧光型拉曼染料，可降低荧光背景干扰，而它与甲醛的加合产物由于存在较好的π共轭效应，具有很强的拉曼信号，因此提高了信背比； （2）金纳米颗粒表面修饰了短的亲水性多肽，可增强金纳米颗粒在反应体系中的稳定性； （3）均相反应，且无需任何的生物分子标记，降低了实验成本，实验步骤简单、易于操作，检测时间短，提高了实验的可操作性。

3.4 实验条件优化

对脂多糖氧化反应中的NaIO4加入浓度进行了优化，结果如图4所示。随着NaIO4浓度的增加，固定浓度的脂多糖（500 mg/L）产生的SERS信号逐渐增强，这主要是因为NaIO4浓度相对于脂多糖是不足够的，因此更多的NaIO4使脂多糖氧化更充分。当NaIO4浓度到达1.1 mmol/L时出现平台，说明NaIO4已经能够氧化全部的脂多糖，且在此浓度下信背比最高，因此选择此浓度进行后续反应。另外，为了保持体系的稳定，NaIO4浓度优化幅度不大，因为过多的Na+会影响体系的稳定性。在实验所优化的范围内体系较为稳定，也未观察到纳米金团聚的现象。

对甲醛选择性反应试剂Purpald的浓度也进行了优化（图5）。由图5可见，随着Purpald试剂浓度的增加，固定浓度的脂多糖（500 mg/L）产生的SERS信号先增加，达到最高值后降低。这是因为足够的Purpald试剂浓度是保证加成反应顺利高效进行的条件，但是过多的Purpald会与加成产物竞争吸附到纳米金表面，降低SERS信号。Purpald最佳反应浓度为22.7 mmol/L，选择该浓度用于定量分析。

4 结 论

构建了基于甲醛选择反应探针用于SERS检测脂多糖的分析方法。方法依赖于脂多糖中含有的邻二醇结构被氧化生成甲醛，甲醛与Purpald发生加成反应，并进一步氧化生成紫色的终产物，该产物组装到多肽标记的金纳米颗粒表面可增强SERS信号。与传统方法相比，本方法无需复杂的化学合成和标记，不需要酶反应，均相、灵敏、快速、易于实现。综上优点，本方法为革兰氏阴性细菌标志分子脂多糖的检测提供了一个简单，方便，灵敏，重现性好的均相检测平台。