鳖甲寡肽I―C―F―6对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响

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摘要：目的 观察鳖甲寡肽I-C-F-6对四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝纤维化的影响，探讨其抗纤维化作用及可能机制。方法 将48只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组和鳖甲寡肽组。每组12只，CCl4腹腔注射建立大鼠肝纤维化模型。鳖甲寡肽组、联苯双酯组按0.12 μg/g体质量皮下注射给药，正常组、模型组给予等量生理盐水，连续7周。检测血清或肝组织中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、白细胞介素（IL）-4、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量；苏木素-伊红（HE）染色光镜下观察组织形态学变化及免疫组化染色观察肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）表达。结果 与模型组比较，鳖甲寡肽组血清ALT、AST水平显著降低，肝组织MDA、TNF-α含量下降，IL-4、IL-10含量升高，SOD活性增强，肝组织纤维化程度明显改善，TGF-β1抗体呈弱阳性表达。结论 鳖甲寡肽I-C-F-6能减轻模型大鼠肝细胞损伤，具有抗氧化和抗纤维化作用。

关键词：鳖甲；寡肽I-C-F-6；抗氧化；肝纤维化；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0042-04

其复方制剂也常用于治疗各类肝脏疾病[1]。鳖甲的药理作用包括抗肝损伤、调节免疫力、抗疲劳、抗突变等[2]。其对肝纤维化影响的物质基础为小分子肽类及寡肽类[3]。本课题组在前期研究中，经系统分离鳖甲水提物，得到一个新的鳖甲寡肽I-C-F-6，该结构可以显著改善四氯化碳（CCl4）所致小鼠的急性肝损伤，结合HE病理组织染色发现，鳖甲寡肽I-C-F-6对CCl4急性肝损伤小鼠具有显著肝保护活性[4]。本实验进一步探讨鳖甲寡肽I-C-F-6对CCl4诱导的大鼠肝损伤及肝纤维化的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物

48只清洁级健康雄性SD大鼠，体质量（170±20）g，北京中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物与主要试剂

鳖甲寡肽I-C-F-6由北京中医药大学中药学院提供，联苯双酯购自北京太洋药业有限公司。DAB显色试剂盒、转化生长因子-β1（TGF-β1）试剂盒购自武汉博士德公司；考马斯亮蓝、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白细胞介素（IL）-4、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；橄榄油（市售）；CCl4为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。

1.3 主要仪器

A&D电子分析天平GR-200型（日本A&D有限公司，编号14213185），手掌型离心机（江苏海门市麒麟医用仪器厂，LX-100），石蜡切片机（德国Leica公司， RM-2135型）；组织包埋机（德国Leica公司，EG-1150C型），OLYMPUS光学显微镜（Olympus公司，CH型），图像分析系统（Olympus公司，Image Pro Plus 5.1），可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司，722s型），酶标比色仪（奥地利，SPECOTRAL型）。

1.4 分组、造模与给药

大鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组和鳖甲寡肽组，每组12只。采用腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液，2次/周，每次2 mL/kg体质量造模。同时，鳖甲寡肽组、联苯双酯组按0.24、0.12 μg/g体质量皮下注射给药，每次2 mL/kg体质量。正常组、模型组给予等量生理盐水，连续7周。

1.5 取材

末次给药后24 h大鼠腹主动脉取血，分离血清，-20 ℃保存待检；大鼠取血处死后，取肝右叶的一小块肝组织，4 ℃生理盐水制成10% 肝匀浆，低温离心待检；从肝左叶切取一块大小1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm的肝组织进行HE染色和免疫组化染色。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠体质量及行为学变化 隔日称重，记录大鼠的体质量变化。观察大鼠的饮食量、毛发光泽度、精神状态等。

1.6.2 大鼠肝脏、胸腺、脾脏脏器系数的变化 将各脏器分别称重，脏器质量与体质量之比为脏器系数。

1.6.3 血清细胞因子及酶学指标检测 按试剂盒说明书ELISA测定IL-4、IL-10、TNF-α。按试剂盒说明书检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性和肝组织SOD、MDA的含量。

1.6.4 肝脏病理组织学检查 用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE及TGF-β1抗体的免疫组化染色后，光镜下观察。

1.7 统计学方法

采用SPSS8.0统计软件进行分析。所有数据均用―x±s表示，计量资料较采用方差分析，计数资料采用卡方检验。P

2 结果

2.1 一般状态

正常组大鼠体质量稳步增长，毛发光泽，生长状态良好；模型组大鼠体质量增长缓慢，毛发干枯，部分出现性格暴躁等表现；联苯双酯组大鼠体质量增长趋于正常组大鼠，鳖甲寡肽组大鼠体质量增长幅度介于模型组与联苯双酯组之间，性情较为温和，偶尔出现打斗现象。实验过程中有动物死亡现象。

2.2 大鼠各脏器系数的变化

与正常组比较，模型组肝脾和胸腺质量明显降低，肝脾系数明显升高（P