基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究

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摘 要：以多克隆抗体包被磁性微球制备捕获探针，以表面负载大量三联吡啶钌标记物的噬菌体展示抗体为发光探针有效放大信号，成功建立了相思子毒素电化学发光免疫传感检测方法。利用本方法检测相思子毒素，浓度在0.005～100 μg/L范围内与电化学发光强度呈良好的对数线性关系，拟合方程为lgY=0.701lgX+1.767（R=0.9964，N=7，p

关键词：噬菌体展示抗体； 相思子毒素； 电化学发光； 免疫传感器

1 引 言

电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）免疫传感器检测蛋白类生物大分子多是以传感器表面固定抗体为捕获探针，以发光标记物如联吡啶钌[Ru（bpy）2+3]标记抗体为发光探针，在靶标存在的情况下，形成“捕获探针-靶标-发光探针”复合物，在电极表面发生ECL反应，以此测定靶标浓度[1～5]。抗体活性以及标记物的量将直接影响检测的灵敏度。对于传统抗体，分子表面可供标记的基团有限，而且多位点标记也可能影响其结合活性，这限制了灵敏度的进一步提高。

噬菌体展示抗体是通过噬菌体展示技术获得的一种可溶性抗体片段或是表面展示有抗体片段的噬菌体[6]，对于后者，其表面除了展示的抗体片段外就是大量的衣壳蛋白。以展示有单链抗体（Single chain variable fragments，scFv）的M13噬菌体为例，M13为丝状，长约900 nm，宽约8 nm，衣壳约由2800拷贝的5 kDa的主要衣壳蛋白pⅧ组成[7]，scFv融合表达在位于一端的约5拷贝的次要衣壳蛋白pⅢ中的1个拷贝上。若进行标记，会有更多的标记物连接在数量庞大的衣壳蛋白上[8]，展示抗体仅仅是“躲在”一端的一个小角落里，从而被标记上较少的标记物，可最大限度避免多位点标记造成的活性降低或消失。因此，噬菌体展示抗体做标记探针能大大增加标记物数量，而又最小程度影响结合活性，从而起到放大信号作用。

本研究以剧毒生物毒素相思子毒素（Abrin）为检测目标，以Abrin多克隆抗体（多抗）包被的磁微球为捕获探针，以Ru（bpy）2+3标记的Abrin噬菌体展示抗体为发光探针，将磁性微球分离富集与噬菌体展示抗体大量负载发光标记物放大ECL信号相结合，建立了一种检测Abrin的新方法，有效放大了检测信号，提高了检测灵敏度。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

磁免疫电化学发光传感检测平台（本实验室与西安瑞迈分析仪器有限责任公司联合研制），MPI-E型电化学发光检测仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）；BIOMATE 3S紫外可见分光光度计（美国赛默飞世尔科技）；HS-3垂直混合器（宁波新芝生物科技股份有限责任公司）；磁分离架（美国Promega公司）。

三联吡啶钌N-羟基琥珀酰亚胺酯（Ru（bpy）2+3-NHS ester，美国Sigma公司），活化生物素（Biotin-NHS ester，美国Sigma公司）；链亲和素包被磁微球（New England BioLabs公司，直径2.0 μm），Abrin、Abrin多抗、Abrin单抗、Abrin噬菌体展示抗体、蓖麻毒素（Ricin）、葡萄球菌肠毒素B（SEB，本实验室）；发光检测液与CleanCell清洗液（北京百隆腾科技发展有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海国药集团有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）用0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl配制而成；实验用水均为去离子水，其它所用化学品和试剂均为分析纯。

2.2.2 捕获探针制备 （1）Abrin多抗生物素化 用1 mL DMSO 溶解活化生物素1 mg，向1 mL Abrin多抗溶液（1 mg/mL）中加入120 μL 活化生物素溶液（即含活化生物素 120 μg）；在室温下持续搅拌，保温2～4 h；加入9.6 μL 1 mol/L NH4Cl（每25 μg 活化生物素加1 μL），在室温下搅拌10 min；超滤除去未结合的活化生物素，以PBS重悬至1 mL。（2）磁微球捕获探针构建 将生物素化的abrin多抗 20 μL加入1 mL（1 g/L）亲和素包被的磁微球中，室温振荡孵育1 h，置于磁分离架上用PBST（含0.15% Tween-20的PBS）清洗两次，PBS清洗两次除去未结合的Abrin多抗，余下结合了Abrin多抗的磁微球，加PBS重悬至1 mL， 4 ℃保存备用。

2.2.3 ECL检测 将Abrin多抗包被的磁微球50 μL与50 μL样品混合， 室温振荡孵育15 min，置于磁分离架上用PBS清洗两次，再加入50μL 标记探针混合后室温振荡孵育1 h，结合磁分离用PBS清洗两次，用发光检测液重悬后加入检测池，磁微球复合物磁铁作用下沉积在工作电极表面，在给定工作电极与参比电极之间恒定电压1.4 V下，标记在噬菌体上的Ru（bpy）2+3就和发光检测液中的三丙胺（TPA）发生ECL反应，光信号由光电倍增管（PMT）检测。整个检测过程如图1所示。ECL反应结束后，将磁铁位置移至离电极最远处，先用去离子水、CleanCell清洗液结合电化学阶跃脉冲清洗检测池与电极，再用去离子水和ProCell发光检测液冲洗，直至ECL值恢复至基线水平（空白信号）后进行下一轮检测。

3 结果与讨论

3.1 发光探针性质

3.1.1 发光探针紫外-可见光谱 如图2所示，Abrin噬菌体展示抗体经标记后其紫外-可见光谱发生改变，a为abrin噬菌体展示抗体光谱图，在269 nm处有一个特征吸收峰，因为噬菌体颗粒为衣壳蛋白内包裹着核酸，269 nm处反映的是DNA的吸收峰；b为标记物Ru（bpy）2+3-NHS ester的图谱，联吡啶钌在220～600 nm之间有3个特征吸收峰，其中可见光457 nm处的吸收对应于金属Ru到bpy配体dππ*电荷跃迁， 紫外区287 nm处的吸收是以配体为中心的ππ*跃迁，紫外区的另一个吸收峰在245 nm处，也是金属Ru到bpy配体的dππ*电荷跃迁[11]； c为Ru（bpy）2+3标记Abrin噬菌体展示抗体的光谱图，位于285 nm吸收峰应对应于联吡啶钌287 nm的吸收峰，254 nm处吸收应对应于联吡啶钌245 nm处的吸收，稍红移，457 nm处为联吡啶钌的特征吸收，这表明Ru（bpy）2+3-NHS ester已经标记到噬菌体展示抗体上。

3.2 孵育时间的确定

因Abrin单链抗体展示于M13噬菌体表面，且M13较大，且为长丝状，其运动相对抗体来说非常缓慢，又因scFv位于一端，这降低了M13与Abrin接触的几率，有必要对孵育时间进行考察。Abrin浓度为50 μg/L时，在加入Ru（bpy）2+3标记的Abrin噬菌体展示抗体后分别孵育10， 20， 30， 40， 50， 60， 70和80 min，随孵育时间增加，电化学发光强度的变化见图4。孵育时间小于60 min时，随孵育时间增加发光强度逐渐增强；孵育时间大于60 min时，发光强度趋于平稳。说明室温下的M13参与的结合反应在60 min后基本达到饱和。因此，加入标记探针后孵育时间定位 60 min。

4 结 论

利用展示有Abrin单链抗体的M13噬菌体作为载体构建发光标记探针，在M13噬菌体表面固载大量的三联吡啶钌信号分子，有效放大了发光信号，成功建立了高灵敏、高特异性的夹心式新型电化学发光免疫传感检测方法。本方法较使用单抗作标记探针在灵敏度上提高20倍，又由于噬菌体展示抗体相对传统抗体的高度稳定性，可依此为基础发展生物毒素的现场痕量检测方法以及开发性能稳定的试剂盒。