IL-10对体外培养的乙肝患者的树突状细胞的作用研究

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【摘要】目的:研究il-10对慢性乙型重型肝炎患者树突状细胞的作用。方法:抽取受试慢性乙型重型肝炎患者外周静脉血,分离提取外周血淋巴细胞,分别采用HBcAg、rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养获得不同分化的树突状细胞,用不同剂量的IL-10刺激培养树突状细胞,检测各组树突状细胞表型与分泌的细胞因子及体外诱导的淋巴细胞毒活性的变化。结果:IL-10处理的树突状细胞膜具备低表达HLA-DR,CD83,CD86分子,低分泌IFN-γ,IL-12p70的特点,体外诱导减弱自体淋巴细胞毒活性,与DC比较结果具有显著性差异(P

【关键词】乙型肝炎;树突状细胞;白细胞介素-10

The Effects of Interleukin-10 on Dendritic Cells from Chronic Severe Hepatitis B Patients

WANG Sikui SHI Qingfeng YUAN Jianguo SONG Jikui GUAN Shan CHA Yan Wang Weihong Wang Kai Xia Qingjie

【Abstract】 Objective:To study the effects of Interleukin-10 on dendritic cells in chronic severe hepatitis B patients.Methods: Monocytes were firstly isolated from fresh peripheral blood of chronic severe hepatitis B patients by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugating and then cultured with plastic-adherence method.Dendritic cells were induced and proliferated from the monocytes with granulocyte-macrophage clony stimulating factor and interleukin-4 for 8 days. Dendritic cells cocultured with Hepatitis B Virus core antigen induced mature dendritic cells. Also dendritic cells were exposed to interleukin-10(IL-10).The expression of surface marker on mature/ tolerogenic dendritic cells was detected by FACS.The cytotoxic T lymphocyte activity, as well as the IL-12p70 , IFN-γ secretion were detected. Results: The secretion of IL-12p70,IFN-γ and expression of human leukocyte antigens, as well as the cytotoxic T lymphocyte activity by dendritic cells were inhibited while treated with IL-10. The Hepatitis B Virus core antigen induced dendritic cells maturation, IL-10 cocultured dendritic cells can be maintained in the immature state when Hepatitis B Virus core antigen plused,too. (P

【Key words】hepatitis B;dendritic cells;interleukin-10

【中图分类号】R620【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2010)011-0009-02

慢性乙型重型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的死亡率较高的疾病,其发病机理被认为主要是由于HBV感染引发的免疫超敏反应。树突状细胞(Dendrtic cell, DC)是已知功能最强的专职抗原呈递细胞,在免疫应答中居于中心调控地位。未成熟DC,称为致耐受DC (tolerogenic DC,Tol DC) [ 1~2],不表达共刺激分子,可以诱导T细胞无能,从而引起自身免疫耐受。Tol DC还可以诱导调节/抑制T细胞来清除免疫反应性T细胞,也可以直接产生IL-10、TGF等细胞因子抑制免疫反应性T细胞,达到诱导外周耐受的目的。IL-10能抑制健康者DC的生长及DC的成熟,产生Tol DC,诱导CTL对抗原产生耐受。我们利用IL-10刺激慢性乙型重型肝炎患者外周静脉血培养的树突状细胞后,检测DC的分化表达和诱导的淋巴细胞毒活性,观察IL-10对慢性乙型重型肝炎患者DC的分化成熟的作用,以期获得稳定的Tol DC,为通过抑制免疫超敏反应治疗慢性乙型重型肝炎的临床实践奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料:

1.1.1 研究对象: 42例慢性乙型重型肝炎患者(PTA小于40%),均为聊城市人民医院和重庆医科大学附属第二医院住院患者,年龄18～38岁。

1.1.2主要试剂:重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4 (rhIL-4)、重组人白细胞介素10(rhIL-10)均购自Peprotech公司。FITC标记的抗人CD83、CD86,PE标记的抗人HLA-DR及各自的同型对照抗体均购自Beckman公司。IFN-γ,IL-12p70 ELISA试剂盒购自Biosource公司。CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自Promega公司。

1.2 方法:

1.2.1 树突状细胞的体外培养:抽取患者外周静脉血20ml,肝素抗凝,利用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞(PBMC),以RPMI-1640培养基重新悬浮细胞,接种于24孔细胞培养板37℃ 5% CO2孵箱培养2h。用无血清的RPMI-1640液轻洗培养板以去除非贴壁细胞,获得贴壁的单核细胞。加入培养液(内含RPMI-1640、15%FBS,100ng/ml rhIL-4 和100ng/ml rhGM-CSF),置于37℃ 5% CO2 孵箱中培养,隔天半量更换培养液(细胞因子添加首次的1/2)。其中取2孔分别在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml,作为1组;2孔在第5、7天加入5μg/ml的HbcAg,作为2组;2孔在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HbcAg,作为3组;2孔在第3、5、7天加入rhIL-10 100ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HbcAg,作为4组;2孔在第3、5天加入5μg/ml的HBcAg,在第5、7天再加入rhIL-10 100ng/ml,作为5组;2孔隔日加RPMI-1640 10μl,作为6组。各组在第8天分别收集悬浮细胞和上清液,悬浮树突状细胞,表型用流式细胞仪进行检测;上清液-70℃冻存,ELISA试剂盒集中检测细胞因子。以RPMI-1640、10%FBS、50ng/ml rhIL-2培养悬浮的混合淋巴细胞,隔天半量更换培养液。

1.2.2 树突状细胞表型的测定:树突状细胞用PBS洗2次,每个检测取5×105个细胞,分别加入FITC/PE标记的CD86、CD83、HLA-DR单抗15μl,混匀后于4℃放置30 min,再用含1%牛血清白蛋白的PBS洗2次,然后用流式细胞仪测定细胞表面CD86、CD83、HLA-DR分子的表达情况。

1.2.3 IFN-γ和IL-12p70的ELISA检测: 按试剂盒说明书介绍的方法,采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定各组上清液中IFN-γ和IL-12p70含量。

1.2.4 DC体外诱导的淋巴细胞毒活性检测:在第8天分别将各组的DC与自体悬浮淋巴细胞混合,以含hIL-2(100U/mL)的RPMI-1640培养液培养,收集共培养5d的淋巴细胞作为效应细胞。取HepG2细胞,按40:1的效靶比加入效应细胞,按实验孔、DC最大释放孔、DC与淋巴细胞自然释放孔、背景及体积对照孔各设三个复孔,共同培养4h,按CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明,检测DC体外诱导的淋巴细胞毒活性。

1.2.5 统计学处理:采用SPSS11.5统计软件包对数据进行分析,结果以x±s表示,各组及组间比较用t检验,P

2 结果

2.1 IL-10对DC的影响:

2.1.1 在光镜下可见大量具有树突样突起的悬浮细胞,经IL-10处理可有效控制培养后的DC散在分布,无明显聚集现象。观察发现HBcAg+DC组的细胞聚集最早最明显,细胞死亡较多,3天后镜下计数与前相比细胞数量明显减少。

2.1.2 表1显示,经流式检测,HbcAg刺激后的HLA-DR、CD83、CD86表达升高。先用IL-10处理后DC对HbcAg的刺激反应性显著降低,但如果先用HbcAg刺激,即使再用高剂量IL-10处理,亦不能有效降低上述炎性因子的表达。

*:与2组比较,差异有显著性,p

1组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml;2组:在第5、7天加入5μg/ml的HBcAg;3组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;4组:在第3、5、7天加入rhIL-10 100ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;5组:在第3、5天加入5μg/ml的HBcAg,在第5、7天再加入rhIL-10 100ng/ml。6组:为对照组,隔日加RPMI-1640 10μl。

2.1.3 图1显示,ELISA法测定的IFN-γ和IL-12p70含量在HbcAg刺激组显著高于IL-10处理组, HbcAg刺激后再用高剂量IL-10处理,亦不能有效降低上述炎性因子的表达。但先用IL-10处理则显著降低其对HbcAg刺激的反应性。

图IL-10对DC分泌IFN-γ、IL-12p70的影响*:与2组比较,差异有显著性,p

1组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml;2组:在第5、7天加入5μg/ml的HBcAg;3组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;4组:在第3、5、7天加入rhIL-10 100ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;5组:在第3、5天加入5μg/ml的HBcAg,在第5、7天再加入rhIL-10 100ng/ml。6组:为对照组,隔日加RPMI-1640 10μl。

2.2 DC诱导的淋巴细胞毒作用。表2显示,在40:1的效靶比条件下,对HepG2的杀伤率结果见表3,经抗原刺激的DC诱导淋巴细胞对HepG2有明显的细胞毒作用(P

无DC空白对照组 27.08±8.59*#*:与2组比较,差异有显著性,p

1组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml;2组:在第5、7天加入5μg/ml的HBcAg;3组:在第3、5、7天加入rhIL-10 60ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;4组:在第3、5、7天加入rhIL-10 100ng/ml,在第5、7天再加入5μg/ml的HBcAg;5组:在第3、5天加入5μg/ml的HBcAg,在第5、7天再加入rhIL-10 100ng/ml。6组:为对照组,隔日加RPMI-1640 10μl。

3 讨论

成熟的DC表达大量MHCⅠ、MHCⅡ类分子、黏附分子、共刺激分子,并能分泌IL-12、IL-6、IL-18等,因而能有效将抗原提呈给初始型T细胞,刺激初始型T细胞活化和增殖,完成起动免疫应答的功能[ 3]。HBV感染可导致外周血DC向肝内迁移,与健康人和慢性乙型肝炎患者比较,慢性乙型重型肝炎肝内浸润了大量DC处于成熟状态,特别是肝内大量浸润的DC分泌IFN调节局部的免疫反应,可能与慢性乙型重型肝炎的发生发展密切相关[ 4]。

由于低表达MHCⅠ、MHCⅡ类分子、黏附分子、共刺激分子,Tol DC携带抗原进入外周淋巴组织后不仅不能激活T细胞,反而诱导T细胞处于失能状态,引起自身免疫耐受[ 5~6],我们的实验结果表明,经IL-10处理后,培养的树突状细胞具备低表达HLA-DR,CD83,CD86分子,低分泌IFN-γ,IL-12p70的特点,与DC比较具有显著性差异(P

参考文献

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作者单位:252000 聊城市人民医院