解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr小鼠粘附分子表达的影响

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[摘要] 目的 探讨解毒祛瘀滋阴方可能的作用机制。方法 以mrl/lpr小鼠80只,分成4组采用RT-PCR技术检测各组肾组织ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平。结果 解毒祛瘀滋阴方合用激素组ICAM-1和VCAM-1mRNA表达低于其他各组。结论 解毒祛瘀滋阴方合用激素能有效降低MRL/lpr小鼠肾组织ICAM-1和VCAM-1mRNA表达水平。

[关键词] ICAM-1;VCAM-1

[中图分类号] R25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)06-22-02

Effect of Detoxification-Stasis Removing-Yin Nourishing Recipe on mRNA Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in MRL/lpr Mice

YANG Kepeng1FAN Yongsheng2WANG Xinchang2WEN Chengping2

1.Zhengzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450007,China;2.The China university of Zhejiang,Hangzhou 310053,China

[Abstract] Objective To study the effect of detoxification-stasis removing-Yin nourishing (DSY) recipe on the mRNA expression of ICAM-1 and VCAM-1 in renal tissue in MRL/lpr mice. Methods We divided 80 MRL/lpr mice into four groups and used RT-PCR to detect the mRNA expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the mouse renal tissue in each group. Results The mRNA expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 in the mouse renal tissue were lower in the DSY recipe plus hormone group than those in other groups. Conclusion The DSY recipe plus hormone can effectively reduce the mRNA expression of MRL/lpr mouse kidney tissue ICAM-1 and VCAM-1.

[Key words] ICAM-1;VCAM-1

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,在我国的患病率约为75/10万人[1]。解毒祛瘀滋阴方是范永升教授治疗系统性红斑狼疮临床经验的结晶,前期研究表明,能有效调节机体细胞因子及其受体、新喋呤水平、影响淋巴细胞凋亡及Fas基因表达等[2-4]。

1材料与方法

1.1实验动物

MRL/lpr狼疮小鼠,雌性,7～8周龄,浙江中医药大学动物实验中心购进。

1.2实验药品

中药复方煎剂,由蚤休15g、青蒿30g、赤芍10g、积雪草15g、生地18g、炙鳖甲10g等12味解毒、祛瘀、滋阴药配伍而成,水煎,浓缩成生药含量1.50g/mL,由浙江中医药大学制剂室提供。强的松悬液,由强的松片溶于生理盐水按含药量0.5mg/mL配制而成。

1.3主要实验器材

RT-PCR试剂盒购自上海捷兰生物有限公司;紫外分光光度计 PharmaciaBio公司,瑞典;PCR温控仪Biometra公司,美国;Tanon 2000紫外分析仪及凝胶图像分析系统,上海天能公司。

1.4实验方法

1.4.1分组与用药随机将80只MRL/lpr小鼠分成4组,20只/组。模型组灌胃生理盐水;中药组灌胃中药解毒祛瘀滋阴浓缩液;西药组灌胃强的松混悬液;中西药组中西药隔日交替灌胃,均约0.8mL/日。用药10周后处死,冰上分离双侧肾脏并迅速置液氮中冻存。

1.4.2肾组织ICAM-1、VCAM-1mRNA表达检测(RT-PCR法)①引物设计由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列:ICAM-1上游引物CATCCCAAAGCTCGACACCC(732位开始),下游引物AACATAAGAGGCTGCCATCACG(1599位开始); VCAM-1上游引物GCTCCAGACATTTACCCAGTT(736位开始),下游引物CACTCTGCCTCTGTTTGGGT(1825位开始); GAPDH上游引物GTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物GGTGAAGA CGCCAGTGGACTC。②异硫氰酸胍-酚:氯仿一步法提取肾组织总mRNA[5],-70℃保存;紫外分光光度计测定mRNA的含量;反转录;③PCR扩增反应液预变性 94℃ 3min;变性94℃,30s退火,59℃ 30s延伸 72℃ 2min(30个循环);延伸72℃ 10min;4℃保存;电泳;紫外透射仪下查看,并拍照。④图像处理用Tanon 凝胶图像分析系统进行光密度扫描,进行半定量统计分析。

1.5统计学方法

实验数据均以均数±标准差(χ±s)表示。使用SPSS11.5统计软件包进行各组间和组内前后相关数据的单因素方差分析。

2结果

2.1 各MRL/lpr小鼠组间肾组织ICAM-1mRNA表达水平比较

模型组mRNA表达水平高于其他组,P

2.2 各MRL/lpr小鼠组间肾组织VCAM-1mRNA表达水平比较

中药组、西药组和中西药组肾组织VCAM-1mRNA表达水平均低于模型组,仅中药组比较差异有显著性,P

3讨论

本病多归属于祖国医学的“阴阳毒”和“日晒疮”等范畴。我们前期研究也发现了SLE患者性激素水平的紊乱(PRL、E2偏高,T偏低)[2]。因此以临床经验为基础筛选出“生地、蚤休、炙鳖甲、青蒿、积雪草、芡实”等12味解毒祛瘀滋阴药。全方以生地清热凉血益阴为君,积雪草、升麻清热解毒为臣,炙鳖甲补阴益肾退热,赤芍、丹参活血散血,蚤休调节免疫俱为佐药,青蒿退热,疏理少阳气机,以为使药[6,7]。临床上我们以解毒祛瘀滋阴方加减并结合激素治疗SLE,取得了较好的协同作用,明显降低ANA、抗ds-DNA和升高补体C3、血小板等免疫指标水平,改善外周血T细胞亚群比例和改善内分泌及性激素免疫调节环路,同时有利于激素的减量和减少感染、骨质疏松、高脂血症等并发症的出现[3,4]。

已有研究表明ICAM-1在肾组织中过多的表达可能加重肾损伤[8]。在自发狼疮小鼠中ICAM-1的表达与肾脏病变严重程度和细胞因子的生成有关,如IL-1、TNF-α等可能介导了肾炎中粘附分子的生成[9]。另有研究证实,VCAM-1也能刺激免疫细胞粘附至肾实质细胞而参与SLE的发病[10]。

本实验显示解毒祛瘀滋阴方与激素合用对抑制狼疮鼠肾组织炎症具有更为明显的作用,可能是通过抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,从而发挥了免疫调节的作用,使病变肾小球炎细胞浸润减少。

[参考文献]

[1] 蒋明,David YU,林孝义,等. 中华风湿病学[M]. 北京:华夏出版社,2004:886.

[2] 王新昌,温成平,范永升. 解毒祛瘀滋阴法对SLE类固醇性血脂异常的防治作用[J]. 浙江中西医结合杂志,2003,13(6): 336-337.

[3] 温成平,李学铭. 中药狼疮定对SLE患者血清sIL-2R和neopterin水平的影响[J]. 中国中西医结合杂志,2001,21(5):339-341.

[4] 温成平,范永升,李学铭. 解毒祛瘀滋阴药并用激素对SLE性激素水平的调节作用[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2003,4(10):580- 582.

[5] 方肇勤. 分子生物学技术在中医药研究中的应用[M]. 上海:上海科学技术出版社,2002:53-58.

[6] 李时珍. 本草纲目[M]. 北京:人民卫生出版社,1982:849-852.

[7] 许德清,曾凡钦. 红斑狼疮[M]. 北京:中国医药科技出版社,2003:9.

[8] Lloyd CM, Gonzalo JA, Salant DJ, et al. Intercellular adhesion molecular-1 dificiency prolongs survival and protects against the development of pulmonary inflammation during murine lupus[J]. J Clin Invest,1997,100:963-971.

[9] Wenpu Zhao,Seth G,Jeffrey B,et al. The Peroxisome Proliferator -Activated Receptor Agonist Pioglitazone Improves Cardiometabolic Risk and Renal Inflammation in Murine Lupus[J]. The Journal of Immunology,2009,183:2729-2740.

[10] Lena Schiffer,Ramalingam B,Meera R,et al. Activated Renal Macrophages Are Markers of Disease Onset and Disease Remission in Lupus Nephritis1[J]. The Journal of Immunology,2008,180:1938- 1947.

(收稿日期:2009-12-09)