降解大豆抗原蛋白枯草芽孢杆菌的筛选及发酵条件
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摘要：用不同来源的１０株枯草芽孢杆菌菌株Ｐ１～Ｐ１０发酵生豆粕，筛选到1株对大豆抗原蛋白７Ｓ伴球蛋白和１１Ｓ球蛋白的降解能力均较强的Ｐ３菌株。采用Ｐ３菌株发酵生豆粕，对发酵条件进行ｐＨ值、接种量、料水比三因素三水平研究，发现在ｐＨ值为６．５，接种量为４％，料水比为１．０∶０．６，Ｐ３菌株可降解９０％以上的抗原蛋白。
中图分类号：S816.34文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－1969-03
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｎ Ｄｅｇｒａｄing Ｓｏｙｂｅａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＳＨＩ Ｈｕｉａ，ＺＨＡＯ Ｓｈｕ－ｍｉａｏｂ，ＬＩＡＮＧ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇｂ
（ａ． Ｃｈｕｔｉａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ； ｂ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ Ｐ１～Ｐ１０ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ fermentate ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ， ａｎｄ ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ Ｐ３ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ７Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ １１Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｐＨ ｗａｓ ６．５， ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ４％， ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ ｗａｓ １.0∶０．６， ｔｈｅ Ｐ３ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ９０％ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｓｏｙｂｅａｎ； ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
大豆粕蛋白质含量高达４０％～５５％，含有人体所必需的８种氨基酸，为全价蛋白源，在动物饲料及人的高蛋白营养保健品中常作为优质原材料［１］。但生大豆中含有多种抗营养因子，且所含的主要蛋白质７Ｓ伴球蛋白及１１Ｓ球蛋白均为大分子蛋白质，有很强的抗原性，能激起特异的免疫应答，食用后不仅会导致血清中抗大豆免疫球蛋白ＩｇＧ滴度的升高，而且会造成小肠局部发生器质性的损伤［２］。试验通过豆粕发酵试验，筛选出1株对抗原蛋白降解能力较高的枯草芽孢杆菌，最大程度地将大分子的抗原蛋白降解为小分子蛋白，从而提高豆粕的食用安全性和蛋白质的利用消化力。
１材料与方法
１．１试验材料
１．１．１试剂Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ抽提缓冲液（０．０３ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值８．０）。
１．１．２原料新鲜生豆粕（购自东海粮油）。
１．１．３菌株及培养基枯草芽孢杆菌Ｐ１～Ｐ１０，ＰＤＡ培养基（含蔗糖）。
１．２试验方法
１．２．１降解大豆抗原枯草芽孢杆菌的筛选
１）试验菌种的准备。将枯草芽孢杆菌Ｐ１～Ｐ１０菌株分别接入ＰＤＡ斜面活化，再分别转接入ＰＤＡ液体培养基中，在３７℃摇床中培养１８ ｈ作为液体菌种备用。
２）豆粕发酵试验。称量豆粕３０ ｇ，将Ｐ１～Ｐ１０菌株以５％和２％的接种量分别接入生豆粕中，加３０ ｍL水混合均匀。将以上混合物装入５００ ｍL阔口罐头瓶，并用塑料薄膜封好，３７℃恒温箱中静置发酵。
３）发酵样品抗原蛋白残留率测定。将未发酵豆粕及Ｐ１～Ｐ１０菌株发酵的豆粕样品在５０℃烘箱中烘干。每种样品各称取１．００ ｇ，加入２０ ｍL ０．０３ ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ抽提缓冲液研磨匀浆［３］，修正各样品ｐＨ值为８．０，浸泡１ ｈ后离心（转速８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，时间１０ ｍｉｎ）去渣，调节上清液ｐＨ值为４．５，离心（转速
１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，时间１５ ｍｉｎ），干燥称重即为各样品中抗原蛋白的质量，抗原蛋白的残留率按下式计算：
１．２．２Ｐ３菌株的豆粕发酵条件的初步研究
１）单因子试验。在温度为３７℃，以接种量、料水比及ｐＨ值３个因素的不同水平发酵大豆粕，测定各发酵样品的抗原蛋白残留率。
２）正交试验。在单因子试验的基础上，选取接种量、料水比及ｐＨ值各３个水平，再设计正交试验，优化发酵条件，测定各发酵样品的抗原蛋白残留率。
２结果与分析
２．１降解大豆抗原蛋白枯草芽孢杆菌的筛选结果
表１结果显示，Ｐ１，Ｐ５，Ｐ６，Ｐ８，Ｐ９菌株发酵的样品中抗原蛋白的残留率高，这些菌株降解抗原蛋白的能力较差。Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４，Ｐ７，Ｐ１０菌株发酵的样品中在５％的接种量下，抗原蛋白的残留率很低，这些菌株降解抗原蛋白的能力较强。其中Ｐ３菌株在２％及５％的接种量下，抗原蛋白的残留率均达到最低，故Ｐ３菌株为降解大豆抗原蛋白效果最好的菌株。
２．２Ｐ３菌株发酵条件初步研究结果
２．２．１接种量试验结果温度为３７℃，料水比为１．０∶１．０，ｐＨ值为７．０条件下，不同的接种量发酵生豆粕，测得不同发酵样品中抗原蛋白的残留率见表２。根据表２，２％的接种量下，发酵样品的抗原蛋白的残留率较大，而４％～１０％的接种量下发酵样品中抗原蛋白的残留率均大大降低，且差异不明显。
２．２．２料水比试验结果温度为３７℃，接种量为４％，ｐＨ值为７．０条件下，不同的料水比发酵生豆粕，测得不同发酵样品中抗原蛋白的残留率见表３。根据表３，料水比为１．０∶０．2、１．０∶０．４时，发酵样品中的抗原蛋白的残留率均较高；料水比为１．０∶０．６、１．０∶０．8、１．０∶1．0时，发酵样品中抗原蛋白的残留率大为降低，且差异不明显。
２．２．３ｐＨ值试验结果温度为３７℃，接种量为４％，料水比为１．０∶０．６时，在不同ｐＨ值下发酵生豆粕，测得不同发酵样品中抗原蛋白的残留率见表４。根据表４，ｐＨ值为６．５时发酵样品抗原蛋白的残留率最低。
２．２．4正交试验结果接种量、料水比及ｐＨ值三因子三水平正交试验结果见表５。根据表５中极差Ｒ值大小，可以看出料水比对抗原蛋白的残留率影响最大；在４％～８％的接种量范围内，接种量对发酵样品中抗原蛋白的残留率影响较小；ｐＨ值在６．０～７．０范围内，对发酵样品中抗原蛋白的残留率影响也较小。且通过表５可直接得出，在ｐＨ值为６．５，接种量为４％，料水比为１.0∶０．６时，发酵样品的抗原蛋白的残留率最小。
２．３抗原蛋白残留率测定结果的验证
试验中抗原蛋白的残留率均为多个重复的平均值，且抗原蛋白的残留率测定结果可以用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果来验证（图１）。
３小结与讨论
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大豆抗原蛋白严重影响饲喂动物的生长发育，消除大豆抗原蛋白，并增加饲料中小肽的含量，在减少对动物生长发育影响的同时，可提高饲料的价值，国内外在此方面已经有较多的研究。张智等［６］、管风波等［７］、吴晖等［８］通过大豆粕发酵产蛋白酶研究了枯草芽孢杆菌不同菌株的发酵能力；程天德等［９］的研究结果表明，利用枯草芽孢杆菌发酵大豆粕，可以降解８５．３９％的大豆蛋白质。试验筛选到1株对大豆抗原蛋白降解能力较强的菌株，通过对发酵条件的初步优化，大豆抗原蛋白的降解率可高达到９０．０％以上，优于目前文献上报道最好的抗原蛋白降解率８５．３９％的结果，具有较好的应用前景。
接种量、料水比和ｐＨ值是影响枯草芽孢杆菌降解大豆抗原蛋白的主要因素，也影响到发酵饲料产品后期干燥的工艺成本。试验对发酵条件的初步优化，发现在４％的接种量、１．０∶０．６的料水比、ｐＨ值６．５的条件下，所筛选到的Ｐ３菌株对抗原蛋白的降解能力最强，接种量及ｐＨ值与文献［１０］研究的结果类似，但料水比只需达到１．０∶０．６，优于他们料水比１．０∶１．０的研究结果，可以减少发酵产品干燥过程中的能量损耗。
抗原蛋白的残留率是评价发酵工艺是否优异，发酵饲料是否达到标准要求的一个重要指标，目前为止，还没有严格的标准来测定发酵豆粕饲料中抗原蛋白的含量。为了快速、准确、高通量地测定发酵饲料产品中抗原蛋白的含量，试验第一次采用抗原蛋白残留率来判断发酵结果。抗原蛋白的残留率是否有意义与抗原蛋白的提取率密切相关，因此需要找到一种大豆抗原蛋白提取率比较高的提取方法，试验采用的是文献［３］的提取方法，抗原蛋白的提取率可达９３．７％。
参考文献：
［１］ 张乃锋，王中华．反刍动物小肽的营养研究进展［Ｊ］．草食家禽，２００２（１）：６－９．
［２］ 冯立志．大豆中的抗营养因子［Ｊ］．饲料工业，１９９３（４）：２１－２２．
［３］ ＴＨＡＮＨ Ｖ Ｈ， ＳＨＩＢＡＳＡＫＩ Ｋ． Ｍａｊｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄｓ： Ａ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｓｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ［Ｊ］．Ｊ ＡｇｒｉｃＦｏｏｄ Ｃｈｅｍ，１９７６，２４：１１１７－１１２１．
［４］ ＦＵＫＵＳＨＩＭＡ Ｄ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， １９９１，７：３５３－３７９．
［５］ ＷＯＬＦ Ｗ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ［Ｊ］． Ｊ Ａｍ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ′ Ｓｏｃ，１９７７，５４：１１２Ａ－１１７Ａ．
［６］ 张智，朱宏亮，钮宏禹，等．响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（１２）：４００－４０４．
［７］ 管风波，宋俊梅．枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶活性的研究［Ｊ］．饲料工业，２００８，２９（１４）：２８－３１．
［８］ 吴晖，卓林霞，解检清，等．发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响［Ｊ］．现代食品科技，２００８，２４（１０）：９７３－９７６．
［９］ 程天德，戴必胜，冯小军．枯草芽孢杆菌蛋白酶水解大豆蛋白的研究［Ｊ］．中国食品工业，２０１０（１）：６０－６１．
［１０］ 卓林霞，吴晖，刘冬梅．枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶优化试验研究［Ｊ］．粮食与饲料工业，２００９（２）：３２－３５．
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