p21基因启动子甲基化对血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化的影响
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摘要：目的 观察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对血管平滑肌细胞（VSMC）p21基因启动子甲基化及对VSMC向泡沫细胞转化的影响。方法 采用组织贴块法培养人脐血管平滑肌细胞，给予不同浓度氧化低密度脂蛋白ox-LDL（0，10mg/L，20mg/L，40mg/L）孵育24h，甲基化特异PCR（MS-PCR）检测p21基因启动子区CpG岛甲基化程度，MTT比色法测定VSMC增殖活性，油红O染色镜下观察计数泡沫细胞比率。结果 ox-LDL呈浓度依赖性促进p21启动子甲基化，同时平滑细胞增殖活性增高，向泡沫细胞转化增加。结论 ox-LDL 可以通过p21基因甲基化促进VSMC向泡沫细胞转化，p21基因甲基化可能在动脉粥样硬化发生中起到一定作用。
关键词：p21基因；甲基化；动脉粥样硬化
动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMC）发生增殖和迁移并转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）形成过程中的核心事件。细胞周期是各种因素刺激细胞增殖的最后信号通路，p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入增殖期。p21等在高胆固醇等促AS因子作用下表达下调，导致动脉平滑肌细胞增殖和迁移， 但在此过程中没有发现p21基因的突变，从而使传统遗传学理论对此无法解释。表观遗传学理论，尤其是DNA甲基化为解决AS等多基因遗传疾病提供了新的思路。DNA甲基化不改变基因编码序列，但启动子区高甲基化将导致基因表达抑制和基因沉默。本课题观察p21基因甲基化对泡沫细胞形成的影响，为阐明AS发病机制提供理论依据。
1资料与方法
1.1一般资料 Gp Genome DNA修饰试剂盒购自Chmicon，PCR试剂盒购自赛百盛公司，四甲基偶氮唑盐和二甲基压砜购自Sigma公司，细胞培养基、小牛血清等购自Gibico。常规化学试剂为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1人血管平滑肌细胞的培养：无菌取剖宫产胎儿脐动脉，剥取中膜按贴块法培养VSMC，取第3-5代用于实验研究。实验前以无血清培养基培养12h使细胞处于静止状态。在无血清培养液中加入0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同浓度OX-LDL刺激24h，未加刺激同时孵育24h细胞作为对照。
1.2.2氧化低密度脂蛋白的制备（ox-LDL）：采用非连续性密度梯度超速离心法分离提取LDL。新鲜人不抗凝血低速离心分离血清，用溴化钾调节密度至1.3g/ml，4°C 50000r/min离心5h，收集LDL，PBS透析，超滤除菌后4°C保存。Lowry法定氮，采用硫酸铜诱导氧化修饰，置于PBS中透析24h后4°C保存备用。
1.2.3 p21 基因甲基化检测：采用甲基化特异性PCR法。饱和酚-氯仿法提取样本DNA，取溶解的DNA样本1ug，参照Gp Genome DNA修饰试剂盒（Chmicon公司）应用亚硫酸盐修饰，回收后提纯行PCR反应。p21甲基化特异引物上游序列为5′-TACGCGAGGTTTCGGGATCG-3′，下游序列 5′-AAAAACGACCCGCGCTCG-3′，扩增产物片段为133bp；p21非甲基化特异引物上游序列为5′-TATGTGAGGTTTTGGGATTGG-3′，下游序列 5′-AAAAACAACCCACACTCAACC-3′，扩增产物片段为133bp。引物由赛百盛生物公司合成。建立50μl反应体系，内含10×反应缓冲5μl ，dNTP1μl，上下游引物各20pmol，Taq酶0.5单位，模板 DNA 5μL，双蒸水补至50μl，覆盖石蜡油，940C 5min 后，进入940C变性1 min ，670C复性1 min ，720C延伸1 min的循环，共35个循环，最后720C延伸5 min，产物行琼脂糖凝胶电泳分离，拍照后扫描条带，以同一样本甲基化条带与非甲基化条带之比进行甲基化程度半定量。
1.2.4 细胞增殖活力检测 MTT比色法。细胞弃去培养液，PBS洗涤，再加入20μL MTT工作液及200μL培养液，4h后吸去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，充分振荡使结晶物融解，490mm波长在酶标仪上测定各孔光吸收值，以试验孔OD均值/对照孔OD均值作为细胞增殖的相对活性。
1.2.5 泡沫细胞的半定量 细胞油红"O"染色，拍照后利用图像扫描仪根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积者记为"-"，面积等于或大于细胞核的面积记为"+"，即为泡沫细胞，每一块玻片计数100个细胞，计算泡沫细胞的阳性率
1.3统计学分析 计量资料数据采用x±s表示，计数资料以百分比（%）表示，所有统计分析均在SPSS12.0软件上进行。P
3讨论
动脉粥样硬化是严重危害人类健康的血管疾病，其发病机制复杂，迄今尚未阐明。血管平滑肌细胞的增殖和迁移受周期依赖激酶（CDK）和细胞周期蛋白共同作用而完成，尤其是G1期过渡到S期受周期蛋白依赖激酶抑制因子的调节。p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入S期。在高胆固醇等促AS因子作用下， p21等抑制增殖因子表达降低，导致SMCs增殖和迁移，成为富含脂质的泡沫细胞 [4]。
基因的甲基化是表观遗传学上对基因表达进行调控的一种常见机制，是最常见的复制及转录后修饰方式，常常导致基因的表达抑制。DNA甲基化是指在甲基转移酶介导下CpG 二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子加上一甲基基团，变成5-甲基胞嘧啶[3]。高度保守的管家基因启动子区富含CpG 二核苷酸，启动子区高甲基化导致基因表达抑制，使该基因沉默和失活[1]。
研究发现相关基因的甲基化在动脉粥样硬化发生发展中起着重要作用。对同型半胱氨酸（Hcy）的研究提示Hcy浓度升高会影响体内许多物质的甲基化过程，Hcy已被认为是独立的致AS危险因子[3，8]。已知AS患者粥样斑块中雌激素受体α（ER2α） 基因的甲基化水平显著增高；体外试验结果证实Hcy可以促进VSMCs向泡沫细胞转化，同时伴有ER2α甲基化增加，上述结果提示ER2α基因表达沉默与AS 形成间存在相关性[8，10]。对动脉粥样硬化兔颈动脉斑块p53基因检测提示其甲基化程度明显增高。
VSMCs的增殖和迁移是动脉粥样硬化的主要病理特征之一，本研究结果表明ox-LDL可以通过影响DNA的甲基化修饰引起p21高甲基化，这可能是其促VSMCs增殖进而引起动脉粥样硬化的重要机制。
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