GM—CSF与创面修复
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糖尿病相关性溃疡、静脉瘀滞性溃疡、烧伤残余创面、深Ⅱ度烧伤创面以及各种原因不明的难愈性创面，在临床上已经成为常见病、多发病，而关于这类疾病的治疗一直是比较棘手的问题，也是多年来中外学者探讨的热点。创伤愈合是一个动态的、复杂的、多细胞协作的过程。该过程中设计的细胞包括：角质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞以及血小板等，在炎症反应以及愈合过程中这些细胞迁移、浸润以及增殖分化，最终修复创面。这个过程被体内的复杂的信号系统调控，包括许多生长因子、细胞因子以及化学因子，其中比较重要的有EGF、 VEGF、gm_csf、 PDGF、CTGF以及IL等[1]。本文主要参阅有关粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granubcyte/macrophage colony-stimulating factor GM-CSF）与创面修复的研究文献，对GM-CSF在创面修复中的作用及应用综述如下。
1 GM-CSF的来源、理化特性以及与创面修复相关的生物学特性
GM-CSF是一种多功能生长因子，最初作为免疫增强剂应用于化疗放疗后以及严重感染等免疫低下患者。GM-CSF是由127个氨基酸组成的蛋白质分子，是具有2个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点的糖蛋白，含有四个半胱氨酸组成的2个二硫键，分子量从14.5～32kd不等的9条蛋白质带组成[2]。GM-CSF由活化的T细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞以及巨噬细胞等分泌，并可以通过自分泌及旁分泌的方式作用于这些细胞，影响其趋化、增殖和成熟[3-4]。创面上的GM-CSF来源于炎症反应细胞（如：巨噬细胞、中性粒细胞）、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等，其中以角质细胞为主[5]。GM-CSF在正常皮肤以及血液中含量极低，难以检测到，形成创面或者炎症刺激后局部皮肤以及血液中GM-CSF水平明显升高，提示其与创面局部反应有关。GM-CSF通过与靶细胞膜上的受体结合，发挥多种生理作用。人体内有多种细胞存在GM-CSF受体，如：粒细胞、红细胞、巨噬细胞等的前体细胞、成熟中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞、成纤维细胞、角质细胞、内皮细胞等。人和小鼠GM-CSF受体均由α、β两条链组成，其中α链是连接亚单位，和配体结合，β链主要和信号转导有关。GM-CSF与受体结合后，刺激膜受体胞内部分的蛋白酪氨酸磷酸化，激活酪氨酸激酶，RAS以及丝裂原活化蛋白激酶等信号转导通路，发挥其生物学效应[6-7]。
2 GM-CSF与创面愈合
GM-CSF最初作为造血刺激因子以及免疫增强剂应用于化疗放疗后和严重感染等患者。自1989年Siena等[8]发现GM-CSF在治疗口腔黏膜炎以及口腔溃疡具有良好效果后，关于GM-CSF与创面愈合的研究逐渐成为研究热点，并取得了丰富成果。
2.1 局部注射GM-CSF对创面愈合作用的观察：研究早期阶段，由于还未研制出GM-CSF的外用剂型，在临床试验以及动物实验中一般采用创面局部注射GM-CSF的方式观察其对创面愈合效果，主要应用于各种难愈性创面。早在1999年，Da Costa等[9]把GM-CSF注射于麻风患者创面周围，发现其可以有效地促进创面愈合。2000年，同样采用创面局部注射的方法，Groves等[10]证实GM-CSF可以引起局部组织中炎性细胞浸润增加，并诱导角质细胞增殖；激活单核巨噬细胞，诱导表皮细胞迁移，并进一步调节细胞因子的产生表达从而促进瘀滞性溃疡，坏疽性脓皮病以及手术切口的愈合。2001年，Fernberg等[11]将GM-SCF局部注射到癌症手术前后放疗导致的慢性溃疡创面，并取得了显著疗效。局部注射GM-CSF可以促进创面愈合在动物实验中也得到有力证实。2002年，Vargel等[12]通过药物外渗的方法制作了大鼠皮肤软组织溃疡模型，并将GM-CSF局部注射到溃疡创面周围，发现其可以有效地促进皮肤软组织坏死创面或者溃疡创面的愈合。糖尿病继发性创面由于微血管病变、周围神经性病变等原因导致细胞增殖受抑和胶原代谢障碍，较难愈合，一直是困扰临床的难题，因而成为研究热点。在既往研究中，通过创面局部注射GM-CSF或者是均匀滴用GM-CSF均可以促进糖尿病足慢性神经性溃疡和糖尿病脂性渐进性坏死患者小腿慢性溃疡的愈合，且复发率低[13]。中外学者均有研究表明，糖尿病小鼠创面中GM-CSF较正常情况下有所减少。方勇等[14]观察到伤后3天糖尿病小鼠创面愈合率较对照组明显降低，伤后7天差异最明显，糖尿病组中性粒细胞和巨噬细胞的浸润在创面愈合早期显著少于对照组，而在后期较对照组略为增多。同时，通过ELISA法检测不同时段创面组织中GM-CSF的表达，发现糖尿病组和对照组创面GM-CSF均于创面形成后第1天即有明显升高，但是糖尿病组到达峰值时间明显延迟。Fang等[15]也观察到在糖尿病小鼠创伤模型早期，糖尿病小鼠创面表达GM-CSF的量较正常小鼠下降了50%。这从另外一个角度说明，GM-CSF在创面愈合中的重要作用。
2.2 局部外用GM-CSF水凝胶对创面愈合作用的观察：随着外用GM-CSF剂型的出现，局部外用GM-CSF是否可以加速创面愈合成为许多学者研究的热点。深Ⅱ度烧伤创面因为烧伤深度较深且不具有植皮手术指征，保守治疗一直是主要治疗方案，疗程相对较长，容易感染，成为治疗难点。Zhang等[16]将GM-CSF水凝胶应用于深Ⅱ度烧伤创面，并对创面全部愈合的时间以及不同时间点创面愈合率等指标进行分析，证实GM-CSF水凝胶可以显著促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合。烧伤残余创面常在深度烧伤治疗后期出现于Ⅲ度烧伤创面皮片间隙，深Ⅱ度创面，以及取皮较深的供皮区，肉芽苍老、水肿，在肉芽创面或已愈皮肤上出现溃疡或糜烂面，难以治愈。邱学文等[17]将重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶局部外用于烧伤残余创面，并观察用药后不良反应和创面愈合时间，以及不同时间点的创面愈合率、总有效率，证实局部外用rhGM-CSF凝胶能促进烧伤后残余创面愈合，且有较好的安全性。
2.3其他有关GM-CSF与创面修复的报道：关于干细胞以及祖细胞的研究有很多，并且涉及各个领域，已经应用到创面治疗中。在关于干细胞促进创面愈合的机制研究中，发现由干细胞分化而来的子代细胞分泌的细胞因子是促进创面愈合的重要因素。Templin等[18]将造血祖细胞及其培养液注射到鼠创面，发现可以促进创面成纤维细胞、血管内皮细胞以及上皮细胞增殖与分化，从而促进创面修复。检测发现造血祖细胞分泌的细胞因子以及培养液成分中含有GM-CSF。无独有偶，Lee等[19]将人胚胎干细胞来源的前体上皮细胞培养液局部外用并注射到创面周围，观察发现可以加速创面肉芽组织的生长以及再上皮化并可以增强已愈合创面的强度和韧性，通过对该培养液成分的分析发现，其含有GM-CSF等细胞因子。局限性肠炎以及慢性溃疡性结肠炎等消化道炎症的一个重要体征就是肠粘膜溃疡，具有难治愈和反复发作等特点，是困扰临床的难题。Bernasconi等[20]研究证实GM-CSF在治疗这类疾病中有确切的效果，可以促进损伤粘膜上皮的修复，加速溃疡的再上皮化，减轻临床症状，并检测到在治疗过程中单核细胞数量增加。
3 GM-CSF促进创面愈合的机制
慢性创面愈合与组织修复的基本病理生理过程包括炎症反应期、细胞增殖期和组织重塑期，而急性创面的出现还往往伴随出血及止血期，这几个过程相互重叠而又按一定顺序进行。研究证实GM-CSF可以启动并参与创面修复的每一个过程[10]。
3.1 GM-CSF与止血期：Kaplan 等[21]发现局部注射GM-CSF可以加快损伤部位出血速度。2007年，Moosbauer 等[22]进一步研究发现GM-CSF可以通过联合血小板活化因子促进组织因子的转录和释放，加速止血过程。
3.2 GM-CSF与炎症反应期：炎症反应是一个复杂的过程，各种炎性因子、细胞因子以及细胞相互影响，相互作用。其中中性粒细胞和巨噬细胞的渗出和吞噬作用是炎症反应的重要特征，可以吞噬和降解细菌、免疫复合物、异物以及坏死组织碎片，发挥抗感染和清创作用，是创面修复的前提和基础，是愈合过程中的重要环节。研究证实，GM-CSF对中性粒细胞和巨噬细胞具有趋化作用，可以增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬作用，加速局部坏死组织的脱落及对入侵细菌的防御能力；并可以促进巨噬细胞合成分泌有利于创面愈合的细胞因子和生长因子，如：PDGF、FGF、EGF、VEGF等[5，23-24]。Canturk[25]给予小鼠全身应用GM-CSF，然后制作切割伤模型，观察血液中性粒细胞计数和功能，皮肤组织切片，以及皮肤中羟基脯氨酸含量，然后和应用生理盐水的对照组比较，发现GM-CSF可以显著增加血液中性粒细胞的计数并可以增强其吞噬功能，并且可以增强愈合组织的韧度。2008年，Kim [26]通过非侵入性的免疫荧光成像技术结合中性粒细胞遗传标记呈现了炎症过程中中性粒细胞向创面的浸润以及增殖的动态过程，为炎症过程中中性粒细胞的浸润提供了更为直观形象的证据；而GM-CSF是该过程的强烈刺激因子，甚至可以达到像金黄色葡萄球菌一样的刺激效果。Fang等[24]制作GM-CSF基因敲除小鼠皮肤损伤模型，观察伤口愈合率、再上皮化程度以及新生血管密度，并和对照组正常小鼠对比，发现以上观察指标明显低于对照组，且创面炎性细胞浸润显著减少，创面IL-6、单核细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎性蛋白的表达明显降低。这从相反的角度表明：GM-CSF在炎症反应期可以分泌相关炎性因子和细胞因子，趋化炎性细胞浸润并增强炎性细胞功能，在炎症期发挥重要功能。
3.3 GM-CSF与增生期：各种难愈性创面的修复过程往往伴有慢性炎症，这种修复过程一般首先通过肉芽组织增生、溶解、吸收损伤局部的坏死组织以及其他异物，并填补组织缺损，同时创缘和创面基底也有上皮组织增生，覆盖于肉芽组织表面，完成修复。肉芽组织在组织损伤后2～3天内即可出现，由新生薄壁的毛细血管以及增生的成纤维细胞构成，并伴有炎性细胞浸润，这一过程包括：血管生成、成纤维细胞增殖和迁移、细胞外基质成分的积聚和纤维组织的重建。作为肉芽组织主要成分细胞的成纤维细胞，是创面修复过程中最重要的细胞，在肉芽组织形成、伤口收缩，细胞外基质及胶原合成、瘢痕形成等方面起重要作用。已有研究证实，正常人皮肤成纤维细胞表面表达GM-CSF受体[27]。Postiglione等[28]研究表明GM-CSF能刺激成纤维细胞表达GM-CSF受体以及细胞增殖，还能促进细胞肌动蛋白和纤粘连蛋白表达，增加细胞外基质合成。另外，GM-CSF对成纤维细胞的刺激作用似乎随创面部位不同而变化。Brem等[29]在慢性创面不同部位取活性组织，提取成纤维细胞并在体外培养，严格传代，使其细胞保留原有的表型特征，然后将GM-CSF作用于细胞，观察发现：创面愈合迟滞创缘来源的成纤维细胞几乎没有迁移能力，而愈合活跃创缘的成纤维细胞迁移最活跃，创面基底来源的成纤维细胞迁移活性居中。虽然大量研究表明GM-CSF可以增强成纤维细胞的迁移、分化、增殖以及合成能力，但是并非所有的实验结果都是支持这个结论，Shao等[30]在体外培养条件下将GM-CSF作用于成纤维细胞，没有观察到GM-CSF对纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。这种差别也许和实验条件、观察指标、检测方法有关，也可能还有一些影响细胞增殖分化的因素需要进一步研究。
新生毛细血管作为肉芽组织的重要组成部分，为细胞分化增殖提供营养成分，在组织再生与创面修复过程起着至关重要的作用。大量研究表明，GM-CSF能够促进内皮细胞的趋化、增殖，从而加速肉芽组织中的血管形成[5]。Wang 等[31]发现GM-CSF能诱导培养基中鼠骨髓来源的内皮祖细胞增殖分化，其细胞表现出典型 的内皮细胞样形态，并形成集落内皮细胞。Fang等[32]研究发现，GM-CSF基因剔除小鼠烧伤后，创面中新生血管化较野生型小鼠明显减少，创面愈合时间延迟，说明GM-CSF通过可以调控创面愈合过程中的血管新生而促进创面修复。
创面修复过程中，首先是肉芽组织增生吸收清除致病因子以及坏死组织，填补组织缺损，然后是上皮组织增生覆盖于肉芽组织之上最终完成创面修复，所以上皮组织增生是创面修复过程中关键的环节。中外学者均有相关报道，认为GM-CSF可以促进上皮组织增生。方勇等[33]将GM-CSF凝胶用于治疗糖尿病小鼠创面，发现GM-CSF可以显著加速创面再上皮化，增加胶原蛋白合成从而促进创面愈合。国外也有相应研究证实，在创面愈合增生期GM-CSF可以刺激新生角化上皮细胞增殖、迁移、分化，从而加速创面的再上皮化[5，34]。
4 展望
各种原因导致的难愈性创面在临床中已经成为常见病、多发病，治疗方法一般包括手术以及保守治疗。但是许多患者由于年龄、一般身体状况以及思想传统等原因或者受经济限制而选择保守治疗。目前基础实验以及临床试验的大部分结论均证实GM-CSF具有促进难愈性创面愈合的作用，GM-CSF参与到创面修复的各个环节，其参与早期炎性反应阶段的分子生物学机制研究的相对较多，具体机制相对清楚。GM-CSF调节创面组织生长促进修复的具体机理研究的相对较少，目前相关数据较少，将成为进一步研究的热点问题。另外，关于GM-CSF促进创面的研究多数以创面局部注射或者外用为主，目前认为创面周围注射途径不仅创面愈合速率要比局部外用要快，而且用药剂量要更加标准，但是大面积创面周围注射尚存在诸多不便。如何更为科学地应用GM-CSF治疗难愈性创面，以及如何合理地与其他外用药物或者创面修复技术联合应用，尚待进一步探讨。
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[收稿日期]2013-02-23 [修回日期]2013-03-21