葡萄球菌凝固酶的检测及临床应用
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【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2012)05－0272－02
【摘要】葡萄球菌凝固酶(Staphylocoagulase)能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。葡萄球菌凝固酶的检测方法主要有玻片法、试管法、乳胶凝集法(slidex staph-kit)和基因扩增法。葡萄球菌凝固酶可用于鉴定致病性葡萄球菌，为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分型。经生物技术加工后的金葡菌滤液，是一种含有多种生物学活性物质的生物制剂，可用于治疗难治性溃疡、皮肤缺损和骨折等。
【关键词】葡萄球菌凝固酶；实验室技术与方法；临床应用
葡萄球菌(Staphylococcus)是革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界的空气、水、土壤中,是最常见的化脓性球菌，也是医院和社区感染常见病原菌之一［1］。据2006年3月原核生物名录(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, LPSN)公布，葡萄球菌属包含39个种，其中11个种可分亚种［2］。葡萄球菌凝固酶，是与葡萄球菌致病力有关的一种侵袭性酶，其作用是使血浆中的纤维蛋白在菌体表面沉积和凝固，以抵抗吞噬细胞的吞噬，此过程亦是血浆凝固的过程［3］。在凝固酶阳性葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌是全球性医院和社区获得性感染最常见的病原菌之一，每年引起全世界范围250万例肺炎，700万例耳部感染和3千例脑膜炎等［4］。因此，及时准确的了解是否有葡萄球菌凝固酶产生并选择合适的检测方法，对准确鉴定致病性葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌，具有重要意义。结合近年来国内外相关文献，本文就葡萄球菌凝固酶的特点，检测方法及其临床应用三方面进行综述。
1葡萄球菌凝固酶的特点
1.1 理化性质
葡萄球菌凝固酶的相对分子质量约为350 000，糖含量为18.1%，主要紫外吸收峰位于260nm处,α-螺旋含量占27.3%，含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸等17种氨基酸， N-末端为天冬氨酸。耐热,粗制品100℃30min或高压灭菌后仍保持部分活性,但易被蛋白酶破坏［5］。
1.2生物学活性
1.2.1凝固性
葡萄球菌凝固酶能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固。该酶有两种类型，一种是分泌至菌体外的游离型凝固酶，与凝血因子共同激活凝血酶原,导致血浆凝固，常用试管法检测；另一种是结合型凝固酶，结合在细胞壁上, 与纤维蛋白原交联而使细菌凝集,常用玻片法检测［6］。Cheng等［7］认为金黄色葡萄球菌能分泌两种具有凝固性的物质，即葡萄球菌凝固酶和血管性血友病因子结合蛋白(von-Willebrand factor binding protein，vWbp)，两者与凝血酶原结合并将其激活，促使血液凝固。
1.2.2抗原性及促T淋巴细胞增值能力
张骞等［5］采用双向免疫扩散试验检测金黄色葡萄球菌滤液制剂（凝固酶是其组要成分）免疫后的动物血液，结果显示凝固酶具有抗原性。随后进行T淋巴细胞增殖试验，表明凝固酶具有促T淋巴细胞增殖能力，增殖指数为1.80。
1.2.3毒力因子
葡萄球菌凝固酶和葡萄球菌的毒力关系密切，是一种重要的毒力因子。Sawai等［8］的研究发现，静脉注射凝固酶阳性菌株DU5789的小鼠肺组织活菌数，明显高于注射凝固酶阴性突变菌株DU5843的活菌数，说明在该小鼠模型的血源性葡萄球菌肺炎发展过程中，葡萄球菌凝固酶可能发挥一定作用。Cheng等［9-10］发现，蛋白A和葡萄球菌凝固酶能促进脓肿形成，而蛋白A抗体以及葡萄球菌凝固酶抗体均能阻止脓肿形成。王英杰等［11］认为α溶血素和凝固酶能通过协同作用引发小鼠乳腺炎，凝固酶促使血液及乳汁等物质发生凝固，导致局部微循环障碍，诱发局部乳腺组织的水肿，进而导致乳腺炎的发生。
2.葡萄球菌凝固酶的检测方法
2.1玻片法
玻片法检测结合型凝固酶,该试验操作简便、快速、价廉,是最常用的操作方法,但影响因素多，假阳性率和假阴性率较高。血浆中凝血因子或者纤维蛋白浓度低，可能导致假阴性，纤维蛋白原浓度过高则可能导致假阳性［6］。该实验阳性的葡萄球菌有金黄色葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施莱福葡萄球菌施莱福亚种及部分中间型葡萄球菌［12］。为提高该试验的准确性，首先，应选用合适的血浆。王婧等［3］研究发现，献血员血浆优于普通患者血浆，多例献血者混合血浆比单一血浆凝块大、反应快。其次，应选择合适的抗凝剂。张才仕等［13］的研究结果表明，EDTA-K2可作为首选抗凝剂。此外，应严格把握判读时间。必须按《全国临床检验操作规程》进行操作,即在10s内完成此试验,若将此实验延时1～2min观察,可使假阳性率高达50%［14］。
2.2试管法
试管法检测游离型凝固酶，操作较繁琐、观察时间较长，但准确度较玻片法高。若游离型凝固酶不足或者活性低则会出现假阴性［15］。某些药物，如凝固酶抑制剂达比加群酯（dabigatran etexilate），也可能会造成假阴性［16］。该试验阳性的葡萄球菌的有金黄色葡萄球菌、施莱福葡萄球菌凝固亚种、中间型葡萄球菌、伪中间葡萄球菌、海豚葡萄球菌及部分猪葡萄球菌［12］。Qian等［17］检测477株金黄色葡萄球菌，得出该试验4小时判读的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为65%, 98.7, 99.7%, 和 88.6%。有文献报道，狗血浆检测凝固酶的凝固时间（均值2.38h）较兔血浆(均值3.19h)短，兔血浆的结果较人血浆更易观察，人血浆比绵羊血浆更敏感（91％的灵敏度与81％）［18-19］，因此，可根据临床不同需求选择更合适的血浆。
2.3乳胶凝集法
乳胶凝集法检测结合型凝固酶，且操作简便，结果快速、准确，但成本较高。该试剂盒是将纯化的纤维蛋白原致敏红细胞表面，特异性单克隆抗体(抗A蛋白)包被乳胶，可排除血浆中某些物质的干扰，有较好的敏感性和特异性［20］。张红升等［15］利用该试验检测110株临床分离的葡萄球菌，结果表明该试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为100%、94.44%、97.72%和100%。
2.4基因扩增法
基因扩增法准确度高，可作为评价其它方法的“金标准”，但费用较昂贵，且受条件限制，暂时难以普及。刘琼等［21］采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)法检测70株葡萄球菌的葡萄球菌凝固酶基因，56株为阳性，与VITEK-Ⅱ全自动分析仪鉴定的结果一致。王英杰等［11］采用PCR法对山东省内20多个规模化牛场乳腺炎病例中分离得到的金黄色葡萄球菌进行检测，其结果与凝固酶试验结果完全吻合，建立了金黄色葡萄球菌性乳腺炎的快速诊断方法。该法灵敏度良好，当模版稀释到1.25×103cfu/ml时,仍能检测到目的条带。
3.葡萄球菌凝固酶的应用
3.1鉴定致病性葡萄球菌
葡萄球菌凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志，将凝固酶试验与A蛋白等试验联合应用，能提高金黄色葡萄球菌鉴定的准确度。刘芳等［22］将A蛋白和凝固酶试验联合应用，检测667株葡萄球菌，其中378株金黄色葡萄球菌，二者至少一株呈阳性的有374株，阳性率为98.9%。在其它葡萄球菌中则为12.4%。两试验联合应用于鉴定金黄色葡萄球菌，准确性达到98.9%，特异性为87.6%。陈道利等［23］通过简便、快速、价廉的耐热核酸酶检测,反映金黄色葡萄球菌产生肠毒素情况,并结合血浆凝固酶试验综合评价其致病力。结果显示，90min之前凝固酶呈阳性的菌株有99.2%产生耐热核酸酶,120min后凝固酶呈阳性的菌株有25%产核酸酶。136株菌血浆凝固酶与耐热核酸酶阳性符合率为90.4%,其中85%菌株可引起食物中毒。说明致病性葡萄球菌在产生凝固酶的同时也产生耐热核酸酶，二者可以互为补充，对于凝固酶表达低的致病性葡萄球菌的鉴定具有重要意义。
3.2金黄色葡萄球菌分型
金黄色葡萄球菌分型方法主要有表型分型和基因分型两大类，其中，表型分型又包括血清学分型、噬菌体分型、耐药谱分型及凝固酶分型等。凝固酶分型是根据抗凝固酶兔血清体外中和试验将葡萄球菌凝固酶分成8个型（Ⅰ～Ⅷ型）。该法简便易行，分型准确率高，但分辨力不强，在流行病学研究中可作为经典方法的补充。孙怡群等［24］研究发现，来自住院患者的68株金葡菌，以III型（28%）和混合型（32.3%）为主，混合型中Ⅲ与Ⅷ占27.3，Ⅱ与Ⅲ型占18.2%。Wichelhaus等［25］同时应用凝固酶基因多态性、spa基因多态性、mecA基因高变区长度多态性及PFGE对46株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）进行分子分型研究， 证实了这三种特异功能集团的多态性分型方法与PFGE分型一致，适合于短时间如几天到几周内的流行病学分析，12h可出结果，而PFGE则需5d或更长时间。
3.3药理作用
金黄色葡萄球菌滤液制剂是将金黄色葡萄球菌培养、过滤除菌后 ,再以生物技术加工制成的含有多种生物学活性物质的生物制剂，其主要成分为凝固酶、蛋白质、多肽及18种氨基酸等。据文献报道，该制剂具有多种药理作用及广泛的临床应用，可用于治疗难治性溃疡、皮肤缺损、骨折、股骨头坏死、肝炎、心包积液等 ［26］。张骞等［5］对金黄色葡萄球菌滤液制剂中的凝固酶组分作了系统分析，发现凝固酶为一类糖蛋白复合物，具有抗原活性，可能在金黄色葡萄球菌滤液的药效方面具有重要作用。
3.4 其它应用研究
代洪等［27-28］研究发现利用低浓度万古霉素诱导金黄色葡萄球菌耐药，15株金黄色葡萄球菌中6株葡萄球菌凝固酶活性降低，其中A18菌株coa基因DNA相对含量有所下降，A56耐药株coa基因序列改变，经测序予以证实。孙怡群等［24］研究发现，68株金葡菌的凝固酶分型以III型和混合型为主。其中MRSA的凝固酶分型情况也如此。各型金黄色葡萄球菌对12种抗菌药物的耐药率显示，Ⅱ、Ⅲ型和混合型耐药率较高，其中Ⅱ型最高，提示金黄色葡萄球菌的耐药性与凝固酶可能有密切关系。
Katsunori Yanagihara等［29］设计并合成了21bp的siRNA来抑制葡萄球菌凝固酶，用RT-PCR检测凝固酶mRNA表达，用出血性肺部感染的小鼠模型来测定体内siRNA的功效。结果显示，siRNA能明显抑制凝固酶mRNA表达，小鼠模型则显示siRNA组活菌数明显下降（P
4.展望
目前对葡萄球菌凝固酶的结构、理化性质、基因结构与功能等尚不甚明了，为进一步加强对该酶的了解并更好的应用，基础研究有待加强。葡萄球菌凝固酶是致病性葡萄球菌重要的毒力因子之一，在葡萄球菌感染疾病发展进程中占重要地位，降低其活性或者减低其产量或许可为疾病治疗提供新的思路与方向。葡萄球菌凝固酶与耐药的形成到底有无关系,是否有助于耐药的形成,或耐药发生后促使该酶发生变化，则需要更深入的研究。
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作者单位：650032昆明医学院第一附属医院