猪卵母细胞极体排出的规律

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摘要：试验把猪卵丘－卵母细胞复合体（Cumulus－oocyte complexes，COCs）于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h，观察它们在不同时间排出的极体数，以研究体外卵母细胞排出极体的规律。结果表明，A级和B级的COCs培养48 h的极体排出率最高 （83．2％和65.7％），明显高于同级水平培养24、32和38 h的；不同级别COCs体外培养相同时间后，A级与B级的极体排出率差异不显著（P0．05），但两者与C级的差异显著 （P0．05）。由此可见，A级、B级COCs 能获得高的极体排出率，培养48 h的极体排出达到高峰，排出过程呈现前期上升快、后期下降慢的变化趋势。

关键词：猪；卵丘－卵母细胞复合体；体外成熟；极体

中图分类号：S828；S814．8 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）24－5172-03

The Rule of Polar Body Release of Pig Oocytes in Vitro

LIU Xi－mei1，HUA Zai－dong2，WEI Qing－xin1，QIAO Xian－feng1，LI Li1，XIAO Hong－wei1

（1 Hubei Key Lab of Animal Embryo and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agriculture Sciences， Wuhan 430064， China；

2． College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract： The polar body extruded from pig cumulus－oocyte complexes （COCs） at different culture time in vitro， such as 24 h， 32 h， 38 h， 44 h， 48 h and 54 h， were calculated to study the rule of polar body release． The results showed that the extruding rate of polar body from COCs of levels A and B cultured for 48h were the highest （83．2％ and 65.7％）， and obviously higher than the same level COCs cultured for 24 h， 32 h and 38 h． The polar rate of COCs of level A and B at the same culture time in vivo had no significant difference（P＞0．05）， but both were significantly higher than the level C（P0．05）． It indicated that COCs of level A and B might obtain highest polar body rate at 48 h of cultured． The extruding of polar body showed increasing quickly in forepart and decreasing slowly in afterpart．

Key words： pig； cumulus－oocyte complexes； IVM； polar body

猪的体细胞克隆技术研究远远落后于其他动物，其主要原因是猪卵母细胞的体外成熟质量比较差、显微操作难度大，加上妊娠维持困难等问题还没有得到解决，所以直到2000年才有所突破，获得了体细胞克隆后代［1－3］。但猪体细胞核移植重构胚的体外发育率仍然相当低，只有大约1％的克隆胚移植后能完成妊娠；其中去核是体细胞克隆的一个重要环节，去核能否成功直接影响到核移植的效率［4］。目前，盲吸法在猪卵母细胞去核中的应用比较多；尽管盲吸辅助荧光染料Hoechest 33342的染色法能提高去核的效率，但有些学者并不支持这种做法。然而盲吸去核的质量好坏和效率高低与卵母细胞的成熟时期密切相关，成熟时间延长，卵龄增加，会使第一极体与中期染色体的位置发生偏转；若去核不完全则会导致克隆胚染色体出现不完整性，造成卵裂异常，影响克隆胚的发育。因此，确定猪卵母细胞体外成熟的最佳时期，是体细胞核移植中盲吸去核成败的关键。试验根据猪卵丘－卵母细胞复合体（Cumulus－oocyte complexes，COCs）的卵丘细胞层数，把COCs分成A、B、C和 D 4个级别，并把前3级的COCs分别体外培养24、32、38、44、48和54 h，以比较它们在不同时间里的发育情况，从而确定COCs体外成熟的最佳时期，为后续研究奠定基础，也为提高猪体细胞核移植技术提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

杜氏磷酸缓冲液（Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS）购自Gibco公司，孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）为宁波激素制品厂产品，其他试剂如未特别注明的，均购自Sigma 公司。卵母细胞体外培养液为改良的M199（mTCM199），在其中添加了3．05 mmol／L 葡萄糖、0．91 mmol／L丙酮酸钠、0．57 mmol／L L－半胱氨酸、1．00 mmol／L L－谷氨酰胺、10 IU／mL hCG、10 IU／mL PMSG、20万IU／mL 青霉素、50万IU／mL 硫酸链霉素、10％猪卵泡液（pFF）；洗卵液用DPBS；融合／激活液由0．25 mol／L 甘露醇、0．1 mmol／L氯化钙、0．1 mmol／L 硫酸镁、0．5 mmol／L 4－羟乙基哌嗪乙磺酸［N－（2－Hydroxyethyl）piperazine－N′－（2－ethanesulfonic acid），HEPES］缓冲液以及质量浓度为0．1 mg／mL的聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）组成；脱卵液用质量浓度为1．0 mg／mL的透明质酸酶DPBS液；胚胎培养液为NCSU－23（North carolina state university－23）加质量浓度为4 mg／mL的牛血清白蛋白（Bovine serun albumin，BSA）组成。

1．2 方法

1．2．1 COCs的采集和分级培养 猪卵巢采自当地屠宰场，置于盛有28～37 ℃ 生理盐水（含青霉素20万IU／mL、链霉素15万IU／mL）的保温瓶内，2 h内送回实验室，用适量生理盐水（28～37 ℃）冲洗3～5遍，采用10 mL注射器（16号针头）抽吸卵泡，卵泡液置于37 ℃水浴保温的50 mL离心管中，静置15～20 min，弃上清液，实体显微镜下观察，捡取COCs，转移到DPBS 液滴中冲洗3遍。根据卵丘细胞的层数将COCs分为4 级，其中A级为包裹5层以上的卵丘细胞；B级为包裹3～5层的卵丘细胞；C级为包裹1～3层的卵丘细胞；D级则是裸卵、死卵。各级别的COCs再用体外培养成熟（In－vitro maturation， IVM）培养基洗涤3遍，放入39 ℃、100％相对空气湿度、5％（体积分数，下同）CO2含量的培养箱中进行培养。另取A、B、C 3个级别的COCs用于体外培养，培养时间分别为24、32、38、44、48、54 h，A、B、C 3个级别的COCs形态见图1。

1．2．2 猪卵泡液制备 抽取卵巢上直径3～8 mm的卵泡，将抽取液放入离心管中，以1 600 r／min离心18 min，上清液用0．22 μm滤膜过滤后，分装于0．5 mL离心管中，－20℃冷冻保存备用。

1．2．3 COCs体外成熟 将体外培养不同时间的COCs，在实体显微镜下观察卵丘细胞扩散情况，用含1.0 mg／mL透明质酸酶的DPBS液脱除包裹在周围的卵丘细胞，选择胞质均匀且排出第一极体的卵母细胞做孤雌激活。

1．2．4 培养不同时间COCs的孤雌激活 取上述脱去卵丘细胞的COCs，用激活液洗涤3遍。再将COCs转移到已经铺满激活液、电极宽度为1 mm的融合槽（美国BTX ECM 2001电融合仪配套电激活槽）中，电融合参数设定为1个10V、5 s的交流电（AC）刺激，紧接着是1个1．6 kV／cm、60 μs的直流脉冲（DC）。之后用NCSU－23加4 mg／mL BSA的胚胎培养液洗涤COCs 5遍，洗涤后将COCs转移到NCSU－23加4 mg／mL BSA液滴内，放入39 ℃、100％相对空气湿度、5％ CO2含量的培养箱中培养48 h后，观察细胞发育的卵裂情况。试验所得数据应用SPSS（Version 11．0）软件进行χ2检验。

2 结果与分析

2．1 COCs的培养

将COCs分别培养24、32、38、44、48和54 h，然后加入1．0 mg／mL的透明质酸酶，反复吹打去除卵丘细胞，用DPBS液清洗2～3次，于倒置显微镜下观察极体的排出情况，结果见图2。

2．2 COCs极体排除规律

试验在同样的条件下培养相同的时间，观察、统计排出极体的COCs数量。结果见表1。从表1可见，A级和B级COCs极体排出率之间在相同时间内差异不显著（P0．05），但两者与C级COCs极体排出率相比差异显著（P0．05）。而各级COCs极体的排出都是从培养24 h开始出现的，随着时间延续而上升，于培养44～48 h达到高峰；之后开始下降。这说明COCs是在逐渐成熟，并于极体排出高峰之后开始老化。同时，从各级COCs在体外培养的极体排出动态（图3）可以清晰地看出，不同级别COCs于体外培养同一时间的极体排出率变化基本呈现出前期上升快、后期下降慢的变化趋势。

3 讨论

试验根据COCs的卵丘细胞层数将COCs分成A级、B级和C级，并分别进行培养，获得A级、B级和C级COCs极体排出的最佳时期，同时对A级、B级和C级COCs体外培养相同时间排出极体的数量进行了比较。结果表明，COCs周围卵丘细胞层数对COCs的极体排出具有明显的影响，A级、B级COCs有利于体外培养，能获得较高的极体排出率，这可能与COCs的卵丘细胞层数有关。据报道，COCs的卵丘细胞层数和质量是影响COCs极体排出的重要因素之一［5，6］。COCs的体外成熟是伴随卵丘细胞的扩散发生的，扩散的卵丘细胞能够调节诸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白质等物质在COCs内的进出，诱导从COCs排出有害因子，从而有效地抑制COCs的退化［7］。而COCs在生长发育中所释放的生长因子对卵丘细胞的发育也有一定的促进作用。COCs与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长，最终促进了COCs的成熟而排出极体［8，9］。

试验发现，A级、B级COCs体外培养48 h的极体排出达到高峰，与培养44 h的极体排出率差异不明显，但明显高于培养38 h及之前的处理，而培养48 h后呈下降趋势，而且卵周间隙明显增大；C级COCs的极体排出率明显较低，这可能与卵丘细胞少、老化严重有关［10］。极体排出是卵母细胞成熟的重要标志，通过此试验，发现极体排出过程呈现前期上升快、后期下降慢的变化趋势，从中也验证了COCs的成熟时间是在培养44～48 h左右，而且A级、B级COCs适合在体外进行培养。

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