揭秘化妆品安全性评价技术(五)
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摘要：化妆品的皮肤吸收是其成分通过皮肤屏障进入体内的过程，它既是其营养功能成分发挥其功效的第一步。同时也是其有害成分产生不良反应的开始，化妆品的皮肤吸收不仅取决于其组分和配方的特性，还与皮肤的生理状态有关。定量检测化妆品及其成份的皮肤吸收过程有助于对产品的安全性和功效性的认识，也是危害物质暴露评估的需要。
皮肤是机体和外界之间的天然屏障，可防止外界有害物质的入侵，也是化妆品经皮吸收和发挥其功效作用的主要途径。皮肤吸收是指化合物穿透皮肤的过程，化妆品成份的皮肤吸收研究，目的是为了获得在正常使用情况下，化妆品成份可能进入人体系统的定性和／或定量的信息。经皮肤吸收是化妆品暴露评估的基础，特别是对于原料和“活性物质”，如着色剂、防腐剂、紫外线过滤剂，以及对使用浓度和使用部位有限制的物质。管理部门通常要求企业必须提交化妆品成份的皮肤吸收资料。对于终产品一般不要求提供皮肤吸收资料，但应该考虑到日常使用时可能出现的最坏情况。在过去的50年里，化妆品的体内经皮吸收试验已较少使用，体外试验技术逐渐成为主流测试方法。
一，皮肤吸收和渗透作用
1、皮肤吸收的过程
化合物接触完整皮肤后，通过皮肤吸收进入体内有3种途径，第一种是通过皮肤细胞间隙的途径，第二种是穿过角质层的跨细胞途径，第三种是通过毛囊、汗腺管、皮脂腺等皮肤附属器途径，或称旁路途径。一般来讲，由于角质层具有低水份和高脂质含量的特点，低分子量亲脂性的化合物透过皮肤的能力优于亲水性的或高分子量的物质。然而，如果长时间接触水份而使皮肤变得含水份较高时，皮肤对亲水性物质的屏障功能自然下降。通常实验动物皮肤的水合能力高于人皮肤，因而提高了皮肤表面物质的吸收速率。通过表皮的扩散速率不单受皮肤厚度的影响，而且根据解剖位置的不同而有差异。在损伤的或病态的皮肤，屏障功能受损，物质可能直接进入循环系统。
外源化学物经皮吸收包括两个时相：穿透相即外源化学物通过被动扩散透过角质层，以及整个表皮层的过程；吸收相即外源化学物通过表皮达到真皮层透过毛细血管壁吸收入血的过程。脂／水分配系数较高的外源化学物易被皮肤吸收。
2、影响皮肤吸收的因素
影响经皮吸收的因素，不仅取决于外源化学物的理化性质(如溶解度，分子量和极性)，而且与皮肤的接触条件密切相关。首先是接触部位，通常身体各部位的吸收速度从前额、腋窝、头皮、背部、腹部、手掌到足掌依次变小；其次是年龄和性别，一般来说，新生儿皮肤渗透性比成人大，女性皮肤渗透性比男性高；第三是皮肤的完整性，损伤部位皮肤的渗透性明显高于完整部位皮肤，当最外层的角质层受到损伤时，经皮吸收量增加数百倍。此外，皮肤的温度、湿度及pH也有影响，温度高、湿度大的情况下，化合物的皮肤渗透速度增加，接触面积大，时间长，经皮吸收也增多。
二、皮肤吸收的体内试验
化妆品成分的经皮肤吸收可用人体体内试验进行评估，通过测量化合物经尿液和排泄物排出体外的量来反映经皮吸收量。但是，实际操作中，体内实验受到许多因素的制约，如检测方法的敏感性、伦理约束、化合物及其代谢产物的排出速率、个体差异等。因此，对于化妆品成分来说，没有实际应用价值。同样，用体内动物实验检测化妆品的经皮吸收也是非常过时的，几乎所有的化妆品安全评价均采用体外方法。除非在必要时，如用于体内与体外方法的对比，特殊活性物质皮肤吸收的确认，可采用无毛的裸鼠进行体内研究(执行OECD 427)。
三、皮肤吸收和渗透的体外试验方法
经皮吸收的体外方法已广泛用于化妆品检测中，如体外扩散池法、人工膜渗透法和数学模型等，其中扩散池试验是评价化合物经皮通透性的最好的方法。
1、体外试验的原理及考虑因素
正常表皮角质层构成了皮肤抵抗外源物质渗透和吸收进入机体的主要屏障，而体外培养的离体皮肤、去真皮表皮层和重建人体皮肤模型，具有与体内相似的屏障结构和功能，因此，可用具有屏障功能的离体皮肤、去层皮肤或皮肤替代物进行体外实验。体外评价方法比体内测试具有优越性，表现在：受试样品可直接接触皮肤表面，操作简单，便于测定；可直接测定化合物透过皮肤的全身吸收速度，避免了尿排泄速度推算法可能带来的误差；对于某些剧毒性物质只能用体外方法进行研究；通过控制实验条件，可改变影响物质通透性的因素，也可模拟体内条件，预测化合物分子经过皮肤进入体内的动力学过程。
但是体外方法也有其不足之处，主要表现在：体外研究中的微循环是不完善的，因此化合物的再吸收能力并不能被充分地研究。表皮通过连续的增生、分化和角化过程不断更新，每天约有一层角化细胞从表皮脱落。局部应用受试物后，外来物质可在体外皮肤中，特别是在角质层和毛囊皮脂腺单位中检测到，而在体内，外来物质可能通过脱屑或皮脂腺分泌而被排出。这些过程在体外皮肤中是不存在的，因此，外来物质在体外表皮中的水平可能高于相应的体内水平。外来化学物经皮吸收的过程包括扩散和代谢两个过程，因此，除了评价物理一化学过程外，还应包括酶的代谢作用。通常离体皮肤仅能代表皮肤中的表皮及真皮上部，不能反映在体皮肤的血管系统、酶系统等对化学物质的通透性及代谢的影响。因此，对于某些物质的评价，体外实验必需与体内实验相结合。
综合以上考虑，体外皮肤吸收研究的方案包括以下内容：选择合适的标准化的皮肤进行研究，选用非标准化的皮肤应当说明其合理性；试验结束后，应进行总质量平衡；应当考虑到受试物在体内可能发生的经皮肤代谢。有时受试物可能会与表皮发生不可逆结合，随后经体内皮肤表面的脱屑作用排出体外，如推测存在这一机制，必须另外的试验加以证明。
2、体外皮肤模型
选择人体皮肤研究化合物的体外经皮吸收作用效果最好，缺点是皮肤来源困难，且存在通透性的个体差异。故更多的实验中选择动物皮肤代替人体皮肤，皮肤来源包括小鼠、大鼠、兔、狗、猪、猴以及豚鼠等。小鼠、大鼠和兔缺少汗腺但毛囊比人类要多，在这些动物中，化合物经皮吸收的毛囊路径很可能起到重要作用。在不同物种间，常用的几种哺乳类实验动物的角质层脂质在总的类型上没有明显差异，主要组成为神经酰胺，胆固醇(包括胆固醇脂)和游离脂肪酸酯，但在脂质数量上种属间有些不同。人们发现大动物比小动物拥有更多的人类所具有的解剖学和生理学特性，对皮肤也如此。因此通常而言，预测人体皮肤通透性时，猪和恒河猴将比无毛小鼠等小动物更为合适。理想情况下，不同种属皮肤通透顺序按如下排列：小鼠>大鼠>豚鼠>家兔>猴>
狗>山羊>绵羊>猪>牛>人。特别是小型猪，它是皮肤毒理学研究的良好动物模型，其皮肤的屏障结构和功能均与人近似。
除了离体皮肤外，还可用体外重建的人体皮肤模型研究皮肤的吸收，这些皮肤模型通常采用人来源的角质细胞，经体外气一液培养，形成具有与人皮肤类似的角质层和屏障结构，皮肤模型可为表皮模型，也可为全层皮肤模型(含真皮层)。目前已有数种商业化的模型供检测使用，如Episkin、EpiDerm等。
3、体外皮肤吸收的扩散池法
体外皮肤吸收最常用的是Franz扩散池，简单讲就是将离体动物皮肤固定于供给池和扩散池之间，将测试样品置于完整的含角质层的皮片表面，皮肤底面与接受池中液体接触，扩散池可设计为静态池也可为流通池。测试样品停留在皮肤表面一定时间，暴露时间或者移除受试物的时间视试验设计目的而定。试验结束后或在试验过程中定时提取接收液，分析透过皮肤的受试物的量，方法分析可采用闪烁计数、高效液相色谱HPLC和气相色谱GC等方法。化学物的被动扩散受温度影响，因此扩散池和皮肤温度应维持在接近正常皮肤温度的范围内(32±1℃)，相对湿度在30～70％。
皮肤屏障功能的完整性是体外试验的关键，试验前应检查皮肤的完整性，可用跨表皮水份丢失(TEWL)或跨皮肤电阻等物理方法测定，体外培养的皮片，电阻值变化维持在35～42kΩ/m2之间，渗透系数
受试物剂量与皮肤通透性的关系还存在争议，欧洲香化协会(COLIPA)建议液体为5ul／Cm2，半固体为2mg／cm2(如与液体比较时使用5mg／cm2)。oECD试验指南(TG428)建议固体为1～5mg／Cm2，液体可达10ul／cm2。也有例外，氧化型染发剂通常给予20mg／cm2和持续30min。扩散池实验一般采用的持续时间为24小时，对于皮肤渗透缓慢的物质可适当延长时间。对于未知其通透性的化合物，取样间隔以2小时为宜。实验初期的取样(1～4小时)对于识别皮肤膜是否渗漏具有重要意义。试验结束后，应测定冲洗液、皮肤膜内和扩散池清洗液中剩余的未渗透的受试物的量，受试物总的回收率至少应在100±15％范围内。如果回收率比较低，应分析原因，可能包括蛋白结合、渗入池壁或管壁、挥发或反应损失。
经皮肤吸收试验中通常会得到以下几个实验数据，反映了皮肤吸收的过程：角质层吸收量表示皮肤扩散试验停止后(暴露时间可能很短)，角质层中贮留的受试物的量，这一数值不能认为是系统吸收量。真皮吸收量表示皮肤扩散试验停止后，表皮(角质层除外)和真皮中发现的受试物的量，这一数值可认为是系统吸收量。经皮渗透量表示皮肤扩散试验停止后，接受池中检测到的受试物的量，这一数值可认为是系统吸收量。
4、人工膜和数学模型
采用无细胞的人工合成膜也可用于化妆品组份的皮肤吸收，人工膜稳定性好，批间均匀度高，使用方便，具有较高的应用价值。合成纤维素薄膜已有比较广泛的应用。多孔薄膜的屏障主要受分子大小、形状、静电作用等制约。相反，无孔薄膜对通透有一定的限速作用，因而更接近于生物组织中的扩散。通常纤维素膜的通透性比生物膜和无孔合成膜高，与扩散分子的性质关系不大。
皮肤可以认为是一种具有屏障功能的生物膜，通透性是生物膜的一种基本性质，它反映了分子、离子通过膜的能力。它可以用每种物质在每秒内通过每平方厘米膜的物质的量，即跨膜通量(mol／・cm2)来表示。化合物质跨膜通量的大小，除了取决于它们在膜两侧的浓度差外，还受这些化合物的脂溶性、温度等其他因素的影响。因此，可以用数学模拟的方法预测，最常用的是定量构效关系(QSAR)模型。QSAR模型是试图将化合物的经皮穿透性和它们的结构或物理化学参数用统计学的方法联系进来的方法。可从化合物的结构定量预测其经皮吸收的情况，在一定的条件下可对化合物能否吸收进行定性预测，用于建立模型的特征性参数包括如下方面：分子量、原子电荷数、电子密度、范德华力、分子体积、辛醇一水分配系数(10gP)、水合作用的能量等。化合物符合以下条件中任意两点，表明其有较差的吸收特性：①相对分子质量>500。②log P>5.0⑧氢键供体>5。④氢键受体>10。
结语
人类志愿者的皮肤吸收研究只能用于低毒性化妆品原料和成品的检验，但通常此类资料非常缺乏。按照OECD指南428，体外试验更适宜用离体动物(啮齿类动物或猪)皮肤或人体皮肤进行，这些资料是可接受的，但人体皮肤来源困难，使用受限；小型猪皮肤是个不错的选择，但需要积累皮肤吸收的比较生物学资料和化学物检测资料；啮齿类动物皮肤吸收资料与人相关性稍差，但却是使用最多和最经济方便的材料来源。对于体外吸收研究中采用体外重建皮肤模型，需要进一步研究以体现其应用前景。皮肤角质层是影响皮肤扩散的主要屏障，因此在试验前必须对角质的完整性进行逐个检查和控制。但是皮肤的代谢活性对于渗透试验并不是必备条件，因为渗透过程主要是被动扩散，而主动运输并不明显。因此，对特殊性质的物质，在必要时应进行体内动物试验。