氧化低密度脂蛋白和一氧化氮的相互作用在缺血性脑卒中发病中的作用
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【中图分类号】R589【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2014）01-0011-01 动脉粥样硬化是脑梗死的主要病理基础，近年的研究结果发现，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）及一氧化氮（NO）在动脉粥样硬化形成中起关键作用。有关缺血性脑卒中患者血浆oxLDL及NO水平的变化已有报道，但两者间相互作用及其在脑梗死发病过程中的病理机制尚少报道。我们通过观察急性缺血性脑卒中患者血浆oxLDL对血小板聚集及NO的影响，进一步探讨oxLDL和NO在脑血栓形成中的共同致病机制。
资料和方法
一、资料
急性缺血性脑卒中患者75例，男49例，女26例，平均年龄（62±13）岁（43～84岁）。病程3天内42例，4～7天33例，平均（4±2）天。符合全国第二届脑血管病学术会议修订的诊断标准。有1次以上CT和MRI检查，排除脑出血、心肌梗死。发病前1个月内未用过阿司匹林等抗血小板药和维生素E等抗氧化剂。肝、肾功能正常。单纯动脉硬化组20例，男15例，女5例，平均年龄（66±9）岁（53～84岁）。颈动脉彩色超声检查有1个以上斑块。均无脑卒中和心肌梗死病史。对照组为45名健康体检者，无心脑血管疾病、高血压及糖尿病病史。颈动脉彩色超声检查未见斑块。平均年龄（60±5）岁（49～69岁）。脑卒中组合并高血压50例（67%），糖尿病10例（13%），高脂血症38例（51%）；动脉硬化组分别为12例（60%），3例（15%）和9例（45%），二组比较差异无显著意义（P>0.05）。
二、方法
1.oxLDL的测定：全部患者于入院次日早8时空腹卧位抽取静脉血，分离血浆，ELISA法测定oxLDL。试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司，按说明书操作。
2.LDL的分离：采用密度梯度超速离心法，分别分离健康对照组、动脉硬化组和脑卒中组患者的LDL，测含量后低温贮存备用。LDL以胆固醇（LDL-C）计量，与血小板孵育时的终浓度为1 g/L。
3.oxLDL的制备：参照Coffey等方法，即将分离得到的LDL在含5 μmol/L CuSO4的等渗盐水（pH 7～8）中透析（透析液体积超过LDL的100倍），当LDL由金黄色转变为灰黄色直至无色透明时，再移至含0.5 mmol/L EDTA（pH 8～9）的等渗盐水中透析，如此重复4次，即得氧化型LDL。测含量后低温贮存备用，与血小板孵育时的终浓度亦为1 g/L。
4.血小板聚集功能的测定：空腹取正常人静脉血，3.28%枸橼酸钠抗凝，500 r/min离心10分钟，上层富含血小板的血浆再以600 r/min离心10分钟，获压积血小板，生理盐水洗涤2次，配成血小板悬液，血小板浓度为2×1011/L，以5 mol/L的二磷酸腺苷为诱导剂，在TYXN-91智能血液凝集仪上测定血小板聚集功能，然后，仍用正常人血小板悬液分别与健康对照组、动脉硬化组及脑卒中组患者的LDL于37℃孵育20分钟，再测血小板聚集功能，而后将动脉硬化组和脑卒中组患者经体外氧化后获得的oxLDL分别与上述同一正常人血小板悬液于37℃孵育20分钟后，再测血小板聚集功能。
5.NO的测定：用0.15 mol/L硫酸锌去蛋白后，以α萘乙烯二胺分光光度法测定NO2-浓度来间接反映NO的含量，分别测定正常血小板悬液与健康对照组、动脉硬化组及脑卒中组患者的LDL和oxLDL孵育前后的NO浓度。
6.统计学处理：数据用均数±标准差（ ±s）表示，组间比较用t检验及直线相关分析。
结果
1.血浆oxLDL水平：健康对照组为（412±144）μg/L，动脉硬化组和脑卒中组分别为（689±83）μg/L和（942±133）μg/L，均明显高于对照组（P
2.LDL、oxLDL对血小板聚集的作用：正常血小板加健康对照组LDL前的最大聚集率为（56±17）%，加健康对照组LDL后为（59±17）%，差异无显著意义（P>0.05）。正常血小板加动脉硬化组患者LDL前后的最大聚集率分别为（50±8）%和（58±8）%，差异有显著意义（P
3.LDL、oxLDL对NO的作用：正常血小板悬液加健康对照组LDL前的NO水平为（0.30±0.02）μmol/L，加对照组LDL后为（0.30±0.02）μmol/L，差异无显著意义（P>0.05）。正常血小板悬液加动脉硬化组患者LDL前后的NO水平为（0.38±0.04）μmol/L和（0.30±0.04）μmol/L，差异有显著意义（P
4.血小板聚集改变和oxLDL及NO含量的关系：脑卒中患者LDL对血小板聚集的增强和血浆oxLDL值呈正相关（r=0.624，P
讨论
LDL可引起血小板功能亢进，聚集性增高，在动脉粥样硬化和缺血性脑卒中发病中有重要的病理学意义，但LDL激活血小板的机制尚不清楚。Imaizumi等和Heery等发现，缺血性脑卒中患者血浆LDL含有较高水平的血小板激活因子样脂质（PAF-LL），具有激活血小板、白细胞，增加粘附聚集的作用，可参与脑卒中的发病。本组结果显示，动脉硬化和缺血性脑卒中患者LDL对血小板聚集均有明显增强的作用，这种血小板聚集的增强和血浆oxLDL水平呈明显正相关，而和血浆LDL水平无相关性。本组结果还显示，患者LDL经体外氧化后，对血小板聚集的促进作用比氧化前更为明显，这表明，LDL对血小板的激活主要是oxLDL的作用。本组中动脉硬化和缺血性脑卒中患者血浆oxLDL水平明显高于正常对照组，但和血浆LDL水平间无相关性，提示LDL的氧化修饰不完全取决于LDL的含量，Chait等研究发现，LDL的不同亚组对氧化修饰的易感性不同，B型LDL颗粒小，密度高，易被氧化修饰，不同个体LDL的基因表达不相同，造成临床上不同个体LDL的致动脉粥样硬化作用的差异，这也是一些脑梗死、颈动脉粥样硬化和冠心病患者血浆LDL水平不高的原因。本组缺血性脑卒中和动脉硬化患者中血浆LDL增高者仅33%和35%，但血浆oxLDL均明显升高，表明这些患者LDL对氧化修饰的易感性增加。
NO具有抑制血管平滑肌增殖、血小板聚集及单核细胞粘附等动脉粥样硬化的病理过程，并可阻止LDL氧化修饰。Lusher等发现粥样硬化的动脉有NO生成缺陷，NO水平的降低和心绞痛、心肌梗死有关；也有报道急性脑血栓期血清NO含量降低，并认为和脑缺血损伤有关，血栓形成对缺血区血管内皮细胞NO合成释放减少。一些学者指出，oxLDL可抑制一氧化氮合酶活性和灭活NO。本文结果也显示，oxLDL在促进血小板聚集时，血小板悬液NO含量明显降低，两者呈负相关，提示oxLDL能抑制NO，致使血管收缩、血小板聚集，从而促进动脉粥样硬化和血栓形成。oxLDL抑制一氧化氮合酶和灭活NO的机制尚不完全清楚，主要是oxLDL的脂质成分，很可能LDL氧化修饰后形成的脂质过氧化物，即溶血磷脂酰胆碱的直接作用。维生素E等抗氧化剂能有效地阻止LDL氧化修饰和oxLDL形成，同时又提高NO水平。因此，在缺血性脑卒中防治中联合应用阿司匹林和维生素E会更有效地防止动脉粥样硬化和血栓的发生、发展，减轻缺血性损伤。