乌司他丁对脂多糖诱导的大鼠肺组织Toll样受体4信号通路表达的影响

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【摘要】目的 探讨乌司他丁对脓毒性大鼠肺损伤的保护机制。方法 选健康清洁级SD大鼠30只，随机（随机数字法）分为生理盐水对照组10只、脂多糖（LPS）组10只、脂多糖+乌司他丁（LPS+UTI）组10只。注药24 h后取肺组织观察形态学改变，分别应用RT-PCR 或Western blot 及ELISA 方法测定肺组织toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）及肿瘤坏死因子TNF-α mRNA 及蛋白表达。结果 脂多糖导致大鼠肺组织损伤，乌司他丁可下调肺组织TLR4 mRNA（t=3.563，P=0.032）、TNF-α mRNA（t=5.147， P=0.028） 及TLR4 蛋白（t=2.692，P=0.041）、 NF-κB 蛋白（t=2.459，P=0.024）、TNF-α 蛋白（t=3.336，P=0.037）表达，并减轻肺损伤。结论 乌司他丁对脂多糖致肺损伤具有一定保护作用，其机制之一可能与抑制TLR4-NF-κB 信号途径转导有关。

【关键词】脂多糖；乌司他丁；Toll样受体4；核因子-κB；肺损伤

Effects of ulinastatin on toll-like receptor 4 signaling pathway in lung tissue of rats after lipopolysaccharide insult HUANG Ri-hong，WAN Xian-yao.Cardiac Surgery Intensive Care Unit，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China

Corresponding author：HUANG Ri-hong，Email：

【Abstract】Objective To investigate the protective mechanisms of ulinastatin（UTI） in lung injury in septic rats. Methods Thirty healthy SD rats of clean grade were randomly （random number）divided into saline control group， lipopolysaccharide（LPS） group and lipopolysaccharide+ulinastatin（LPS+UTI） group（n=10， in each）. The lung tissues were obtained for morphological observation at the 24th-hour after LPS injection. RT-PCR or Western blot， ELISA methods were applied to measure the expressions of Toll-like receptor 4（TLR4）， nuclear factor（NF）-κB， tumor necrosis factor（TNF）-α mRNA and their protein levels. Results LPS injection could result in lung injury. UTI could down-regulate the expressions of TLR4 mRNA（t=3.563，P=0.032），TNF-α mRNA（t=5.147，P=0.028）， TLR4 protein （t=2.692，P=0.041）， NF-κB protein（t=2.459，P=0.024）and TNF-α protein（t=3.336，P=0.037）in lung， and could in turn alleviate lung injury. Conclusions UTI showed protective effects on LPS induced lung injury， and one of the mechanisms was perhaps associated with the inhibition of TLR4-NF-κB signal transduction pathway.

【Key words】Lipopolysaccharide；Ulinastatin；TLR4；NF-κB；Lung injury

肺是全身性感染导致脏器功能损害早期受累的器官，如果在急性肺损伤阶段处理不及时，会继续进展至急性呼吸窘迫综合征乃至多器官功能衰竭甚至危及生命。因此，探讨全身性感染早期有效的肺保护机制，将为全身性感染的治疗提供确定的理论依据。Toll样受体（TLR）能够识别病原体，并在病原体入侵机体的早期启动天然免疫，促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答，脂多糖（LPS）激活TLR4信号转导通路后导致核因子-κB （NF-κB）激活，使炎症因子大量表达，导致全身炎症反应和多器官功能衰竭的发生。乌司他丁（Ulinastatin，UTI）作为蛋白酶抑制剂目前作为免疫调理药物应用于脓毒症治疗，对肺组织有一定保护作用，本研究拟通过LPS腹腔注射建立脓毒症模型，观察UTI对TLR4信号转导通路的作用，探讨UTI肺保护的具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和仪器

SD大鼠30只，雄性，体质量（350±25） g（大连医科大学SPF实验动物中心）；LPS（Sigma公司，来源： Escherichia.coli O111：B4，规格： 500 mg）；乌司他丁注射液（华瑞制药有限公司，规格： 100 ml，20 g）； 低温超速离心机：5804R型，德国Eppendorf 公司生产。超低温冰箱：MDF-382E型，日本SANYO公司生产。梯度PCR仪：NO.533104516，（德国Eppendorf 公司）； DU7500分光光度仪（美国Beckmen公司）；RM6240BD多功能生理记录仪（成都仪器厂）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；RS232C型核酸测定仪 （德国Eppendorf 公司）；GDS-800型凝胶扫描成像系统（美国UVP公司）；HPIAS系列彩色病理图文分析系统（华海电子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将大鼠随机（随机数字法）分为3组，对照组10只：生理盐水5 ml腹腔注射；LPS组10只：腹腔注射LPS，10 mg/kg稀释至5 ml；乌司他丁LPS+UTI组10只：于注射LPS同时再次给予腹腔注射乌司他丁5万U /kg。于注射药物后24 h处死动物。LPS组注药后部分死亡，补足动物注射LPS，使进入统计动物达10只。

1.2.2 肺病理学观察 取右中叶肺组织10%甲醛常规固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4 μm，HE染色，显微镜下观察。

1.2.3 肺组织TLR4、TNF-α mRNA测定 用Trizol RNA 提取试剂盒对保存在液氮中的肺组织进行总RNA 抽提与纯化，然后反转录为cDNA。RT-PCR 按照试剂盒说明书进行操作，采用50 μl 反应体系。2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像系统摄像并分析各条带A 值（基因表达值= 目的基因/ 内参照） 。以β-actin 为内参照。基因引物序列如下：TLR4sense：5’-CGCTTTCAGCTTTGCCTTCA

TTAC-3，antisense：5’-AGCTACTTCCTTGTGCCCT

GTGAG-3’。TNF-αsense：5’-GTAGCCCACGTCGTA

GCAAA-3’，antisense：5’-CCCTTCTCCAGCTGGAA

GAC-3’。β-actinsense：5’-AACCCTAAGGCCAACC

GTGAAAAG-3’，antisense：5’-TCATGAGGTAGTC

TGTCAT-3’。TLR4的PCR反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃ 10 min。扩增片段长度555 bp。TNF-α PCR反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，分别33、35个循环，72 ℃ 10 min。扩增片段长度分别为346 bp。β-actin扩增片段长度241 bp。

1.2.4 肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白测定 取0.2 g 肺组织按照凯基白提取试剂盒说明书分别提取胞浆及胞白。提取液以BCA 法测定蛋白含量。混匀上样，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（12 V/ cm、2 h） ，将电泳结合反应物转移到尼龙膜上，5%BSA 封闭4 ℃ 16 h，TLR4一抗（1∶400）或NF-κB p65一抗（1∶500）37 ℃孵育 1 h，TTBS洗涤，滴加1∶1000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37 ℃孵育1 h，DAB显色扫描，应用计算机凝胶成像分析系统测定各条带的积分光密度值。

1.2.5 肺组织TNF-α蛋白测定 取肺组织匀浆液上清200 μg按照西唐ELISA试剂盒说明书操作检测各组肺组织TNF-α蛋白含量。

1.3 统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用统计学软件SPSS 11.0的One Way ANOVA法比较组间差异，组间两两比较采用LSD-t检验，以P

2 结果

2.1 肺组织病理改变

对照组肺组织小叶结构清晰，肺泡壁无增厚，间质无充血水肿。LPS组肺泡壁显著增厚，间质充血水肿，肺泡腔内出血，UTI组肺组织结构异常明显减轻，间质轻度充血水肿，部分肺泡壁增厚（图1）。

2.2 肺组织TLR4、TNF-α mRNA表达变化

与对照组相比，LPS组肺组织TLR4、TNF-α mRNA表达明显升高，差异具有统计学意义；UTI组较LPS组有所下降，但仍高于对照组（图2、表1）。

2.3 肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平变化

与对照组相比，LPS组肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义；UTI组较LPS组有下降趋势，但未恢复正常水平（图3、表2）。

2. 4 肺组织TNF-α蛋白表达水平变化

LPS组肺组织TNF-α蛋白表达水平为（8.14±0.59），与对照组的（3.62±0.28）相比明显升高，差异具有统计学意义（P

3 讨论

LPS是革兰氏阴性菌的细胞壁组成成分和其主要致病成分，可以导致全身性感染和急性肺损伤。TLR4作为LPS的受体，负责对细菌内毒素的识别。目前认为LPS具体的信号转导通路为：LPS与细胞膜上TLR4-CD14-MD-2复合物结合后，活化的TLR4胞内尾状结构与接头蛋白MyD88结合，激活MyD88-IRAK-肿瘤坏死因子受体相关因子6 （ TNF-α receptor associated factor 6，TRAF-6） -核转录因子κB诱导激酶（NF-κB inducing kinase，NIK） -NF-κB 抑制物诱导激酶（ IкB inducing kinase， IKK） 信号通路，使IкBα磷酸化降解，IκBα降解后与NF-κB分离致NF-κB被释放，迁移到胞核内启动靶基因的转录，诱导TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子及趋化因子、急性期反应蛋白表达，启动炎症级联瀑布反应，最终导致全身性感染[1]。肺是感染诱发多脏器功能障碍综合征最早受累器官之一，LPS可以直接导致肺巨噬细胞脱颗粒，线粒体、内质网肿胀等超微机构损害而引发肺组织充血、水肿、出血、透明膜形成等肺损伤表现[2]。为控制炎性反应，人们曾尝试应用TNF-α、IL-6的中和抗体进行试验性治疗，但能否降低内毒素血症的致死性结论并不一致[3-4]，而且由于TNF-α的早期释放，使其在临床上很难成为有效的治疗靶点。近年来，随着针对炎性通路的干预性实验研究不断深入，TLR4作为LPS的信号转导通路的关键环节，逐渐成为全身性感染治疗的新靶点[5]。

研究发现，将TLR4基因屏蔽后可明显降低胰腺炎小鼠血清TNF-α、IL-1、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮及肌酐水平[6]，同时可降低烫伤小鼠微血管通透性[7]；应用TAK-242抑制TLR4信号通路，可使内毒素休克小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、MIP10水平下降，并降低内毒素致死率[8]。

乌司他丁是从尿液中提取的胰蛋白酶抑制剂，可以抑制多种蛋白、糖和脂类的水解酶活性，抑制炎症介质的释放，并可以改善微循环和组织灌注。尤其对于感染性休克患者，可抑制病情进展，减少SIRS 、MODS的发生[9]。另有实验证实乌司他丁可以抑制酵母多糖诱发的TLR4基因表达，并可保护器官功能[10]。本实验研究亦提示，乌司他丁同样可抑制脂多糖诱导的TLR4基因及蛋白表达，对肺损伤有明显的保护作用。其机制分析与乌司他丁能够通过抑制LPS诱导的TLR4活化，下调TLR4-MyD88-IRAK-TRAF-6-NF-κB信号通路的转导，减少其下游细胞因子TNF-α的表达，进而减少TNF-α介导的炎性损伤及继发器官功能障碍，从而减轻LPS性肺损伤。本实验从一定程度上揭示了乌司他丁肺保护的分子机制，并为今后乌司他丁在全身性感染患者的临床治疗提供了确实的理论依据，但炎症信号通路错综复杂，具体机制尚待进一步研究。

参考文献

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（收稿日期：2012-04-19）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.11.010

作者单位：116011 辽宁省大连，大连医科大学附属第一医院心外科ICU（黄日红），重症医学科（万献尧）

通信作者：黄日红，Email：

中华急诊医学杂志2012年11月第21卷第11期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.11

P1226-P1229