斑马鱼TNFR2基因克隆及表达分析
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摘要：利用巢式PCR方法克隆斑马鱼（Danio rerio）肿瘤坏死因子受体2（tnfr2）基因，该基因全长1 242
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1.2.3 斑马鱼TNFR2基因表达谱分析 解剖分离斑马鱼11个组织（肌肉、脑、眼、腮、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠道、精巢和卵巢），收集斑马鱼7个不同发育时期的胚胎（受精后6、12、24、36、48、96和120 h），参照“1.2.1”方法提取各组织的总RNA并合成cDNA。cDNA稀释5倍后作为Realtime qPCR模板备用。内参基因为β-actin，上下游引物分别为： 5′-ATGCCCCTCGTGCTGTTTTC-3′和5′-GCCTCATCT
CCCACATAGGA-3′。斑马鱼TNFR2基因Realtime qPCR上、下游引物分别为：5′-CTGGTGCTGTTGTG
GTGG-3′和5′-GGCTCTGTCTGGGTTCTG-3′。Realtime qPCR反应体系为：2×Realtime PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL，灭菌双蒸水补至20 μL。Realtime qPCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。利用“ABI PRISIM 7900HD SDS”软件进行相对定量数据分析，胚胎发育表达谱分析中将TNFR2基因在鱼卵受精后24 h胚胎中的表达量设定为1，组织分布表达谱分析中将TNFR2基因在肠道中的表达量设定为1。
2 结果与分析
2.1 斑马鱼TNFR2基因全长的克隆
以斑马鱼总RNA为模版，反转录获得cDNA，通过巢式PCR后，扩增得到斑马鱼TNFR2基因全长，以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（图1）。从图1中可以看出，扩增产物条带清晰，与目的片段大小一致（约1 242 bp）。
2.2 斑马鱼TNFR2基因的生物信息学分析
斑马鱼TNFR2基因全长1 242 bp，编码413个氨基酸，分子质量为44.68 ku，等电点5.90。通过“SMART”工具分析，斑马鱼TNFR2蛋白质在22-60、62-104、105-148以及150-188氨基酸残基位点存在4个“TNFR家族半胱胺酸丰富”结构域（TNFR/NGFR family cysteine-rich region domain），在蛋白质中部存在一个跨膜结构域（图2）。“TMHMM”工具分析证实跨膜结构域位于斑马鱼TNFR2蛋白质第238-260氨基酸残基。斑马鱼TNFR2蛋白质跨膜结构域表现出疏水性，其余部分均表现出强亲水性。
2.3 鱼类TNFR2蛋白质的系统发育分析
通过选取具有代表性的鱼类TNFR2蛋白质序列，构建了系统进化树（图3），从图3中可以看出，TNFR2的进化趋势和物种进化趋势基本一致，斑马鱼TNFR2与和其亲缘关系最近的鲫鱼TNFR2最先聚类到一起。
2.4 斑马鱼TNFR2基因表达分布分析
利用实时荧光定量PCR技术，对斑马鱼TNFR2基因在胚胎发育时期和成鱼各个组织的表达分布进行了分析（图4）。在整个发育过程中，TNFR2基因均有表达，但表达量不一致。斑马鱼卵受精后6 h为整个胚胎发育时期表达最高峰，从12～120 h时TNFR2基因表达量均维持到一个较低水平，并且变化不大。
TNFR2在斑马鱼不同组织中均能检测到，且表达丰度差别不大：TNFR2在肌肉中表达最高，在肠道中表达最低，在肌肉中的表达丰度也仅为在肠道中表达丰度的6倍左右（图5）。
3 小结与讨论
TNFR1与TNFR2均能与TNFα结合，且具有一定的同源性，其差别在于TNFR1含有一个死亡结构域（Death domain），而TNFR2则不含此结构域[9]。本研究中克隆获得的基因经序列分析，不含有死亡结构域，确定为斑马鱼TNFR2。在鱼类TNFR2蛋白质中，均具有极为类似的核心结构，其主要差异在于末端长度，这部分序列很可能是冗余区域，在进化中逐渐被简化淘汰。
表达谱分析结果显示斑马鱼TNFR2基因mRNA水平在整个胚胎发育期呈现明显的“下降后保持稳定”模式，表明TNFR2对斑马鱼胚胎形成具有重要意义，且其表达量受时间严格控制。TNFR2具有细胞炎症放大的免疫学功能，在胚胎发育过程中与早产密切相关[10]。胚胎发育的早期，斑马鱼等低等脊椎动物可能通过TNFR2的高表达应对外界环境压力，发挥免疫学功能。而随着胚胎发育的逐步完善，大量免疫蛋白的合成，TNFR2的免疫学功能被其他免疫蛋白取代，表达量开始急速下降，表达量及时下降避免了TNFR2诱导的病理性损伤，与人类比较相似[11]。TNFR2在所检测的斑马鱼11个组织中均有表达，且表达丰度差别不大，说明它是组成型表达，与哺乳动物TNFR2基因mRNA表达较为相似。人类TNFR2的高表达可以影响肠上皮细胞内稳态，与肠道慢性炎症呈正相关[12]。斑马鱼肠道TNFR2基因mRNA表达量最低的原因可能与此有关，即证明从鱼类到人类，TNFR2尽管同源性变化较大（仅30%左右），但在进化压力胁迫下依然保持了原始的基因功能。
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