体外共培养环境对犬脂肪干细胞、口腔上皮细胞的影响

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【摘要】 目的：探讨体外共培养环境对犬脂肪干细胞（ADSC）、口腔上皮细胞（OK）移行速率、增殖速率的影响。方法：获取犬ADSC和OK并鉴定，将两种细胞种植于同一个刻度培养皿内，检测共培养环境下细胞的移行速率，与单一细胞培养环境作对比，观察细胞移行速率的改变。收集两种细胞培养上清，加入到对方培养基中，形成体外模拟混合培养环境，MTT法检测细胞增殖曲线的改变。结果：共培养环境下，OK、ADSC细胞的移行速率均较单一细胞培养环境下高。与常规培养相比，在体外模拟共培养环境下，OK、ADSC细胞的增殖曲线均变陡。结论：在体外共培养环境中，ADSC、OK呈现互相促进、互相吸引、协同增殖态势，细胞的移行速率、增殖速率均得到提高，能够共同用于组织工程口腔黏膜的构建。

【关键词】 脂肪干细胞； 口腔上皮细胞； 组织工程； 共培养

中图分类号 R329.2 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）36-0001-03

各种原因造成的尿道狭窄、尿道缺损是一个难题，近年来，口腔黏膜被认为是用于尿道重建的较为理想的替代物。但口腔黏膜的获取，也会给患者带来诸如感觉麻木、开口及活动受限等合并症。组织工程技术的发展为这一难题的解决带来了新的希望[1]。组织工程口腔黏膜有望成为尿道重建领域一个理想的修复重建材料[2]。脂肪干细胞（adipose tissue derived stem cell，ADSC）是2001年Zuk等[3]从人脂肪组织中分离培养出的一种多能干细胞，它能够经由旁分泌方式，分泌多种生长因子，这些生长因子能够激活上皮细胞，促进上皮缺损的修复[4]。将ADSC引入组织工程口腔黏膜研究，将具备良好的应用前景。本实验研究体外共培养环境对犬口腔上皮细胞（oral keratinocytes，OK）和ADSC增殖速率、移行速率的影响。

1 材料与方法

1.1 ADSC的获取和鉴定

取Beagle犬腹部皮下脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶（Worthington，美国）消化获得ADSC，以含10% FBS的DMEM培养液（Gibico，美国）培养，每3天换液一次，细胞融合达90%时，以0.25%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化传代。取P3 ADSC，行流失细胞检测，检测细胞表面CD34、CD44、CD45、CD90、CD105和CD106的表达。

1.2 OK的获取和鉴定

取Beagle犬颊黏膜，经2.0 U/ml的Dispase Ⅱ（Roche Corporation， Germany）消化、0.05%胰蛋白酶（Gibico，美国）消化后，获得OK，以KSFM培养基培养，细胞融合达到90%时，以0.05%胰蛋白酶消化传代。取P1 OK，爬片，行免疫荧光检测细胞AE1/AE3的表达。

1.3 细胞移行速率的检测

将P3 ADSC和P1 OK种植到同一个刻度培养皿的两端，每日定时检测记录细胞的移行速率，作为对照，刻度培养皿两端均种植ADSC或OK，记录细胞移行速率。

1.4 细胞增殖速率的检测

在ADSC细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成ADSC条件培养基（ADSC-CM），培养OK细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。在OK细胞达到50%融合时，每日收集培养液上清，经过滤除菌后，与KSFM培养基1∶1比例混合，形成OK条件培养基（OK-CM），培养ADSC细胞，MTT法检测细胞的增殖速率。同样检测正常培养条件下OK、ADSC的增殖速率。

2 结果

2.1 成功获取ADSC和OK

经酶消化法能够顺利获得ADSC和OK，ADSC呈纺锤形，少数有突起，为不规则状（图1左），细胞相互之间以细丝拉网。流式细胞检测表明CD90、CD34、CD44、CD105表达呈阳性，CD106、CD45表达呈阴性。OK细胞呈多角形，融合后的细胞呈现典型的“铺路石”样外观（图1中），细胞形态均一、稳定。免疫荧光见细胞AE1/AE3表达阳性（图1右）。

2.2 共培养环境下细胞移行速率升高

在单一培养环境下，ADSC移行速率为0.8～5.5 mm/d，共培养环境下ADSC的移行速率增高为0.8～6.8 mm/d。单一培养环境下，OK移行速率为0～1.5 mm/d，共培养环境下OK的移行速率增高为0.2～2.5 mm/d（图2）。

2.3 共培养环境下细胞增殖速率升高

MTT检测表明，与常规培养相比，ADSC-CM培养环境下OK细胞的增殖曲线明显变陡。同样，OK-CM培养环境下ADSC细胞的增殖曲线也呈变陡趋势（图3）。

3 讨论

尽管报道的尿道狭窄修复的手术方式众多，但直到今天，复杂尿道狭窄的治疗仍然是一个难题。口腔黏膜由于具有容易获取、取材部位隐匿、修复成功率高等优点，近年来被广泛用于尿道重建[1，5]。但口腔黏膜的获取，仍具有麻木感觉、开口受限、活动障碍等口腔并发症[6-7]。组织工程技术的发展为尿道重建带来了新的治疗选择。

组织工程是应用生命科学和工程学的原理和技术，在正确认识组织结构和功能关系的基础上，研究开发应用于修复、维护、促进人体各种组织和器官损伤后的功能与形态替代物的一门新兴学科。其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维复合体。种子细胞、支架材料和组织器官构建是组织工程研究的三大要素[8]。构建组织工程口腔黏膜，用于尿道重建，无疑具有良好的前景[2]。脂肪组织中包含大量能够向间质组织分化的前提细胞，即脂肪干细胞[3]。脂肪干细胞的获取比其他成体干细胞更为容易，创伤更小，更容易被患者接受。且之前有报道表明，脂肪干细胞能够合成和分泌bFGF，KGF，TGF-β，HGF和VEGF等生长因子，从而能够促进伤口愈合，且表现出抗氧化效应[4]。这些生长因子由脂肪干细胞通过旁分泌方式分泌，能够促进胶原的合成和皮肤表皮细胞的迁移，激活皮肤成纤维细胞和上皮细胞，从而促进伤口愈合。在组织工程移植物修复皮肤缺损时，脂肪干细胞还能加速移植物中新生血管形成[9]。