耐多药大肠埃希菌质粒介导的耐药基因检测

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【摘要】目的　了解泸州本地质粒介导的耐多药大肠埃希菌的TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3,CTX M-22、CTX M 24基因分布情况。方法 用Ｋ-Ｂ法进行耐药菌株的筛选。PCR扩增耐药基因。琼脂糖凝胶电泳检测基因大小。基因测序仪检测碱基序列。结果　71株大肠埃希菌中,有一株死亡。全敏6株，占8.57%,单耐16株，占22.86%,双耐18株，占26.71%,耐多药30株，占42.86%。耐多药质粒中携带：TEM有11株 , 占36.67%;SHV仅一株，所占比例较低, 占3.33%;CTX M 有23株,占76.67%; CTX M 3有21株，占70%,两种基因均含有的有12株，占40%;CTX M-22有 9株, 占12.86%；CTX M 24有 24株，占34.29%，两种基因均含有的有6株,占20%；有6株含有CTX-M-24,CTX-M两种基因。结论　泸州地区耐多药大肠埃希菌存在质粒介导的TEM、SHV、CTX-M、CTX-M-3、CTX M-22、CTX M 24基因。有3种菌株无上述六种耐药性质粒，其余的每一种菌株含有2种或者2种以上的耐药性质粒，最多的菌株含有5种耐药性质粒。耐多药的大肠埃希菌对第三代头孢菌素的头孢唑肟敏感，对头孢他啶，头孢哌酮，头孢曲松，丁胺卡那霉素中度敏感。对亚胺培南，美罗培南敏感。

【关键词】大肠埃希菌　耐多药　质粒介导TEM SHV CTX-M CTX-M-3　CTX M-22 CTX M 24

大肠埃希菌是感染性疾病中最常见的G－菌，也是医院内感染常见菌，其耐药性普遍存在，有对一种或者两种甚至多种抗生素耐药[1]，在染色体和质粒介导的耐药机制中，以质粒介导的耐药机制在耐多药传播中更具重要性。本文讨论TEM,SHV,CTX-M,CTX-M-3，CTX M-22、CTX M 24六种质粒介导的耐多药基因在本地区的分布情况,给临床选用抗生素提供一定的理论依据。

１　材料与方法

1.1　材料

1.1.1 菌株来源　泸州医学院于2007年至2008年收集的71株临床送检标本，来源于大便，尿液，痰液，血液，腹水，分泌物等，无重复分离株，发现其中一株死亡。质控标准菌株ATCC25922系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.2 抗菌药物纸片　包括左氧氟沙星（LVF），诺氟沙星(NOR)，环丙沙星(CIP)，加替沙星（GAT），阿莫西林(AMX)，氨苄西林（AMP），哌拉西啉/他唑巴坦(PFP/TAZ),头孢唑啉(CFZ)，头孢他啶(CAZ)，头孢唑肟（CFX）,头孢曲松（CFT），头孢哌酮（CPZ），头孢噻肟(CTX)，头孢噻肟/克拉维酸（CTX/CA）, 头孢西丁（FOX），头孢噻吩(CEF)，氨曲南 (ATM)，庆大霉素(GM)，妥布霉素(TM)，链霉素(S)，丁胺卡那霉素（AMK）,亚胺培南(IPM)，美罗培南（MPM），均系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.3　试验试剂　LB粉，Augar粉，胰蛋白胨大豆肉汤粉，酪蛋白琼脂，酪蛋白粉，CTX M、CTX M 3，CTX-M-22,CTX-M-24,SHV,TEM六种基因的PCR引物，质粒小提试剂盒，２×Taq PCR Master Mix，溴化乙锭，5倍的TBE，2000pb的Marker，均由上海生物工程有限公司生产。限制性核酸内切酶EcoRI，系美国Fermentas生物工程公司生产。BLOWEST AGAROSE 系 Gene Tech(ShangHang)Company生产。大肠标准菌株ATCC25922，0.5硫酸钡比浊试剂系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.4　实验仪器 天津上海跃进医用光学器械厂GNP-9082隔水式电热恒温培养箱，哈尔滨东名医疗仪器厂HZQ-C恒温空气摇床，上海安亭科学仪器厂TGL-16C型离心机，上海科析试验仪器厂XMTD型KXS恒温水浴箱，英国Hybaid公司Omn-E PCR扩增仪，北京六一仪器厂DYY-8C型水平电泳仪，上海顾村电光仪器厂ZF-90多功能暗箱式紫外投射仪，美国基因公司DNA/RNA800凝胶DNA成像仪，美国NanoDrop公司ND-1000蛋白核酸定量仪等。

1.2 方法

1.2.1　用制作的胰蛋白胨大豆肉汤，M-H液体培养基，LB液体培养基，37℃振荡培养细菌16小时，M-H固体培养基，LB粉与琼脂制作的LB琼脂平板培养24小时，细菌药敏试验K-B纸片法筛选出耐多药的大肠埃希菌。各种培养基制作标准和药敏试验判断标准按2006 纪绍梅编著《微生物培养基质控与图解》[2]。不同的抗生素有不同的标准,分为耐药（Ｒ），中度敏感(Ｍ)，敏感(Ｓ)。菌液稀释以0.5麦氏单位硫酸钡比浊管浓度为标准。在直径９cm的平皿培养基上每个共放７个药敏纸片，两张纸片中心距离3cm，纸片与平皿边缘1.5cm，一株菌两个平皿。对三类或者三类以上的抗生素耐药的菌株判定为耐多药。

1.2.2 碱裂解法提取质粒　按说明书操作，其中菌体量取1.5ml，加大P1,P2用量，加用去蛋白酶液。漂洗后在室温中开盖10分钟，彻底去掉其中的乙醇，避免影响后续反应。质粒洗脱液EB加100ul。

1.2.3CTX-M-22,CTX-M-24，CTX-M,CTX-M-3,SHV,

TEM基因的扩增和克隆。30株耐多药的大肠埃希菌和大肠埃希菌标准菌株同时进行六种基因的扩增和克隆。六种基因引物信息见表１，每一个PCR反应体系共35ul,其中模板7ul，引物1对各5ul，２×Taq PCR MasterMix 15ul，ddH2O 8ul。PCR反应循环的设置，94℃，预变性3min,94℃,变性30sec, 55℃，退火30sec, 72℃, 延伸1min, 共３０个循环,72℃再延伸5min。

1.2.4　２%的琼脂糖凝胶电泳 电泳液原液蒸馏水５倍稀释，标准菌株ATCC25922作为对照，电压100v，电流强度100MA,时间45分钟，电泳结果用紫外光观察，阳性结果的PCR产物送上海生物工程有限公司测序仪检测基因序列。