PEG胁迫对番茄幼苗叶片SOD同工酶的影响

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摘要：以4个番茄品种为材料，采用改进的氮蓝四唑光还原法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法，研究了经聚乙二醇模拟干旱胁迫处理后，番茄幼苗叶片超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性及酶谱的变化。结果表明，4个番茄品种的SOD同工酶活性均较对照明显增加，各品种的胁迫系数高低顺序依次为中蔬4号、中杂105、Money maker、中杂9号；模拟干旱胁迫处理没有使各品种SOD同工酶酶谱条带数目出现增加，仍为3条，SOD同工酶条带对干旱响应敏感程度的大小排序依次为SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，其中SOD-Ⅲ条带的酶谱亮度、带宽在处理与对照之间均明显增加，增加程度大小的品种排序依次为中蔬4号、中杂105、Money maker、中杂9号，与胁迫系数一致，说明SOD与干旱胁迫密切相关的同工酶为SOD-Ⅲ，其可能是番茄耐旱品种SOD同工酶活性较高的根源；所以SOD-Ⅲ条带可作为番茄抗旱生理育种的筛选指标。

关键词：番茄；聚乙二醇；胁迫；超氧化物歧化酶同工酶

中图分类号：S641.2；Q945.78；Q554 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1833-03

干旱是影响作物生长和产量的重要环境因素之一，其会使植株在形态特征、理化特性方面发生一系列的变化，导致作物体内聚集大量的活性氧等有害物[1]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）同工酶作为作物响应干旱等逆境胁迫的防御性保护酶之一，可以有效地清除超氧阴离子自由基、防止脂质氧化、减少对膜系统的损伤[2]。SOD广泛存在于植物体内，已有报道表明在干旱胁迫下会引起植物SOD同工酶活性[3-5]及酶谱的变化[6]，但未见干旱胁迫对番茄（Solanum lycopersicum L.）SOD同工酶酶谱影响的报道。聚乙二醇（Poly ethylene glycol，peg）是一种高分子渗透剂，能导致作物组织和细胞处于类似干旱的水分胁迫状态之中，但本身不穿越细胞壁进入细胞质，不会引起质壁分离[7]，因此是作物模拟干旱胁迫试验的良好替代品。本试验采用PEG-6000模拟干旱胁迫处理，对番茄幼苗叶片的sod同工酶活性及酶谱的变化进行了比较，以期揭示其变化规律，旨在为番茄抗旱生理育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试番茄品种有中杂105（S. lycopersicum cv. Zhongza 105）、中杂9号（S. lycopersicum cv. Zhongza No.9）、中蔬4号（S. lycopersicum cv. Zhongshu No.4），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供；另一个番茄品种Money maker（S. lycopersicum cv. Money maker）由荷兰瓦格宁根大学植物育种系提供。

1.1.2 试剂与药品 主要试剂有乙醇、HgCl2、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲硫氨酸、氮蓝四唑（NBT）、四甲基乙二胺（TEMED）、EDTA-Na2、核黄素等，均为分析纯；Hoagland培养液和磷酸盐缓冲液自配，模拟干旱胁迫用品20% PEG-6000也为分析纯。

1.1.3 仪器 主要有DYY-Ⅲ型电泳仪及配套电泳槽、电源（北京六一仪器厂）、DK-S电热恒温水浴锅（上海棱谱仪器仪表有限公司）、PL2002 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、PHS-3G pH酸度计（上海雷磁仪器厂）、FYL-YS实验用冰箱（北京福意电器有限公司）、KR-GZ人工气候室（河南科瑞科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 材料处理与取样 每个番茄品种挑选100粒饱满种子，经1 g/L HgCl2溶液消毒8 min，去离子水反复冲洗；吸胀7 h后28 ℃催芽72 h，将萌发一致的种子置于含1/2 Hoagland培养液的培养盆中水培，定苗6株/盆，然后移入昼夜温度为（26±2）℃/（19±2）℃的人工气候室内，幼苗经20 d（可长出约2或3片真叶）培养，以加入20 % PEG-6000的1/2 Hoagland培养液的幼苗水培为处理组（模拟干旱胁迫处理），同时设不加20% PEG-6000的幼苗水培为对照组，均3次重复。在培养期间，每12 h相应更换1次培养液，以减少试验的浓度误差。在试验开始时（0 h）和处理后的24、48、72 h分别对2组番茄幼苗的叶片取样分析。

1.2.2 SOD同工酶活性测定 ①SOD粗提。剪取不同处理各番茄品种幼苗叶片（去叶脉）0.5 g，加入1 mL预冷的50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8，内含1% PVP），冰浴研磨至匀浆，加磷酸盐缓冲液补充至终体积5 mL，匀浆液于4℃ 10 000 r/min离心15 min，上清液即为SOD粗提液。② SOD活性测定及胁迫系数计算。采用改进的NBT光还原法，酶的显色反应体系为：50 mmol/L 磷酸盐缓冲液1.50 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液0.30 mL，0.75 mmol/L NBT溶液0.30 mL，0.1 mmol/L EDTA-Na2 溶液0.03 mL，去离子水0.25 mL。各取2.65 mL反应混合液转入4支透明度好的试管内，并编号，1号、2号试管再各加入磷酸盐缓冲液0.05 mL、20 μmol/L核黄素溶液0.30 mL，分别作为暗环境对照（调零对照）、光环境对照；3号、4号试管再各加入酶液0.05 mL、20 μmol/L核黄素溶液0.30 mL，并置于4 000 lx光照度、25 ℃下反应20 min，作为样品测试管；反应结束后，在560 nm 处测定吸光度，以每克样品（鲜重）抑制NBT光还原的50%为1个酶活性单位[8]。采用以下公式计算SOD活性，酶活单位为U/g（FW），求样品测试管酶活性的平均值。

SOD总活性=[（ACK-AE）×V]/（0.5×ACK×W×Vt）；

ACK为光环境对照管的吸光度值，AE为样品管的吸光度值，V为样品液的总体积，Vt为测定时样品的用量，W为样品鲜重。

胁迫系数是植物在发育过程中抗胁迫能力高低的一种表述，其计算公式为：

SOD胁迫系数=处理组SOD总活性最大值/相应对照组SOD总活性值。

1.2.3 SOD同工酶电泳 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，上样酶量30 μL，在浓缩胶（浓度为4%）里稳流20 mA，进入分离胶（浓度为8%）后稳流40 mA，6～7 h完成电泳。同工酶电泳染色采用NBT染色法，凝胶依次经染液Ⅰ（0.2% NBT溶液）在黑暗下染色20 min、染液Ⅱ（0.001%核黄素溶液+0.33% TEMED溶液+36 mmol/L、pH 7.8 磷酸盐缓冲液）在黑暗下染色15 min、染液Ⅲ（0.003% EDTA-Na2溶液+50 mmol/L、pH 7.8 磷酸盐缓冲液）在光照下染色20～30 min，转换染液期间需用去离子水冲洗凝胶，最终用95%乙醇浸泡5 min，再转入去离子水中照相，可使SOD酶带呈现出清晰透亮的酶谱。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对番茄幼苗叶片SOD同工酶活性的影响

在20% PEG-6000模拟干旱胁迫处理72 h内，4个番茄品种幼苗叶片的SOD同工酶活性动态变化情况见图1，处理72 h时的SOD同工酶活性与胁迫系数比较情况见表1。从图1可见，各品种在处理24、48、72 h的SOD同工酶活性均明显高于对照组，不过Money maker的SOD同工酶活性于48 h达到峰值后因持续胁迫出现了下降，其他3个品种于72 h达到峰值并呈有差异的上升趋势，说明在一定干旱程度下，番茄可以通过提高SOD同工酶活性来适应干旱逆境，且品种间适应持续干旱的能力存在差异。由表1可知，番茄品种的胁迫系数高低顺序依次为中蔬4号、中杂105、Money maker、中杂9号，说明品种间SOD同工酶活性响应干旱胁迫的程度明显不同，其中中蔬4号响应积极，具有相对较强的清除活性氧和修复损伤、适应胁迫环境的能力。

2.2 PEG胁迫对番茄幼苗叶片SOD同工酶酶谱的影响

采用20% PEG-6000模拟干旱胁迫处理24、48、72 h后，获得的4个番茄品种幼苗叶片SOD同工酶酶谱见图2。根据酶带电泳迁移率的大小，可将酶谱分为SOD-Ⅰ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅲ 3个条带。与对照组相比，各品种处理组的酶谱条带仍为3条，没有新增酶带，其中SOD-Ⅰ条带酶谱亮度、带宽在处理与对照之间无明显差异；SOD-Ⅱ条带仅中杂105、中蔬4号的处理48、72 h的明显增加；4个品种SOD-Ⅲ条带均明显增加，增加程度大小的排序依次为中蔬4号、中杂105、Money maker、中杂9号。分析表明，SOD同工酶条带对干旱胁迫响应敏感程度的大小排序依次为SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，各品种间SOD-Ⅲ条带的酶谱亮度、带宽增幅与胁迫系数一致，因此SOD-Ⅲ条带的表现可以作为番茄抗旱生理育种的筛选指标参考。

3 讨论

在正常生长条件下，植物体内的活性氧产生与清除机制保持着一定的动态平衡，但在干旱胁迫下这种平衡将被打破，造成活性氧大量积累，即氧化迸发；而与清除机制有关的SOD、过氧化氢酶（Catalase，CAT）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）等保护酶就会协同防御活性氧对细胞膜系统的破坏，以减轻干旱胁迫对植物的伤害，重新建立动态平衡[9]。试验发现，PEG模拟干旱处理后，番茄幼苗叶片的SOD同工酶活性明显增加，进一步证实了SOD具备抗氧化的生理功能。SOD是生物机体内天然的自由基清除剂，可催化·O2-发生歧化反应而产生H2O2和O2，从而清除活性氧，缓解干旱胁迫造成的膜系统损坏。进一步研究发现，4个番茄品种间适应持续干旱的能力存在差异，且胁迫系数不同，这与经PEG处理的小麦（Triticum aestivum L.）[6]、小黑麦（Triticum×Secale cereale）[10]、新疆野苹果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]及平邑甜茶[M. hupehensis（Pamp.）Rehd. var. pingyiensis Jiang][11]等的研究结论相似。

试验结果表明，在PEG模拟干旱胁迫下，4个番茄品种的SOD同工酶酶谱条带数都没有增加，仍为3条，对干旱胁迫响应敏感程度的大小排序依次为SOD-Ⅲ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅰ，品种间SOD-Ⅲ的酶谱亮度、带宽增幅与胁迫系数一致，这说明SOD与干旱胁迫密切相关的同工酶为SOD-Ⅲ，其可能是番茄耐旱品种SOD同工酶活性较高的根源；因此SOD-Ⅲ酶带可以作为番茄抗旱生理育种的筛选指标。然而这与翁明阳[6]的研究结果不尽相同，他认为经PEG胁迫的小麦幼苗有2条SOD同工酶带表达明显，特异位点POD和CAT同工酶条带的表现才可作为鉴定小麦抗旱性强弱的指标；出现这样的差异可能是试验所用材料的不同产生的。本研究SOD同工酶酶谱变化较客观地揭示出了番茄的抗旱机理，将为进一步选育番茄抗旱新品种提供参考依据。但是，抗旱机理研究是一个十分复杂的过程，PEG胁迫对番茄叶片其他保护酶（POD、CAT等）的影响尚需进一步探讨。

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