西双版纳滇重楼传粉生物学研究
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摘要 目的：为今后滇重楼良种繁育和杂交育种提供依据。方法：观察滇重楼花部行为和传粉媒介；用TTC染色法和联苯胺-过氧化氢法测定滇重楼花粉活力和柱头的可授性；估算杂交指数的值；进行田间人工授粉试验。结果：滇重楼花朵开放早期，柱头裂瓣微张，花药从外轮散粉，柱头和自花花粉距离相对较远，推测利于异交；花朵开放后期，柱头裂瓣完全外张，全部花药散粉，柱头和自花花粉距离拉近，推测利于自交。滇重楼花存在部分雌性先熟的现象；柱头寿命大概10～12 d；花药散粉后，前2 d花粉活力平均保持在10%左右，前10 d花粉活力平均保持在20%左右。杂交指数为4；结实率试验和传粉媒介观察表明滇重楼自交亲和，不具备主动自交的能力；试验居群自然情况下异花结实率低，主要依靠自花辅助传粉结实；异花传粉主要依靠风媒，自花传粉主要依靠蜘蛛吐丝结网。结论：滇重楼为混合系统，自交、异交特征并存。滇重楼花部行为和雌性先熟在实现避免雌性干扰、促进异交和延迟自交方面具有重要适应意义。滇重楼是风媒-虫媒传粉植物，传粉媒介因环境而变化。花粉限制是滇重楼居群在自然条件下结实率低的主要原因。
关键词 花部行为；雌性先熟；系统；传粉媒介；花粉限制
收稿日期 2012-12-07
基金项目 中国医学科学院药用植物研究所云南分所所长基金项目（YZYN-11-05）
通信作者 *李戈，助理研究员，主要从事中药材栽培技术及病理研究，Tel：15368912754，E-mail： 植物繁育系统是一个系统的研究，Heywood将其定义为指控制群体或分类群内自体受精或异体受精相对频率的各种生理和形态机制[1]。其包括花综合特征、花各性器官的寿命、花开放式样、自交亲和程度和系统，及传粉者和传粉行为，其中系统是核心[2]。关于系统，自然界绝对自交或杂交的植物类群很少，大多是二者兼而有之的混合模式。异交可以丰富物种的遗传背景，增强物种对环境的适应力，但异交有2个限制因素，一是物种对雄性投资很大，二是受环境限制，比如高山上昆虫多样性低，传粉者少，植物很多有向自交进化的趋势[3]。在不可靠的传粉条件下，自交是有利的，不仅可以提供繁育保障[4]，还可以保持子代与母代遗传一致性[5]。但同时自交的后代个体的遗传多样性降低，对环境的应变能力弱，后代适合度下降[6]。另外自交容易造成自交衰退，自交种子在发芽、存活、生长的各个阶段都不及杂交种子[7]。总之过度的自交或异交都可能导致植物适合度的下降，很显然中间程度的杂交便成了最适系统[8]。
重楼属植物全世界共有24种，我国种类最多，达19种[9]，在已见的报道中，重楼属植物均属于常异花植物。其中崔大练[10]对黑龙江地区的北重楼的传粉生态学进行了研究，发现北重楼以自花传粉为主，异花传粉为辅。Jacquemyn[11]对四叶重楼研究发现其除了能够异花结实外，亦具有延迟主动自交的机制。
滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.）Hand.-Mazz主要分布在云南及其周边地区[12]，被2010年版《中国药典》收载。滇重楼研究多集中在花粉活力和柱头可授性方面，只有杨斌[13]对云南丽江地区的滇重楼授粉特性进行了研究，结果显示滇重楼是常异花植物，自然条件下以异花授粉为主。笔者对西双版纳地区的滇重楼结实特性进行了长期观察，发现其在自然情况下结实率很低，种子质量层次不齐，访花昆虫也少见。由于植物的传粉生物学特性与环境密切相关[2]，本研究结合云南省的自然环境条件，研究滇重楼在西双版纳的传粉特性，主要集中在系统，及与之相配套的花部行为、性器官寿命、传粉者和花粉限制几个方面，旨在明确滇重楼的繁殖策略，找到滇重楼在自然情况下结实率低的原因，为生产上提高滇重楼种子结实率提供指导，同时为滇重楼良种繁育和品种选育提供理论基础。本文主要就以下4个问题进行探讨：①滇重楼系统；②滇重楼花部行为适应意义；③滇重楼性器官寿命；④滇重楼的传粉者及其花粉限制。
1 材料
试验地位于医学科学院药用植物研究所云南分所西双版纳州勐海县种植基地，海拔1 215 m，年平均气温18.5 ℃，最冷月12.3 ℃，最热月22.8 ℃，年降水量1 523.1 mm，年平均日照时数2 061.4 h。试验材料选自种质圃中2010年期间在云南各地引种栽培的滇重楼种质。
2 方法
2.1 花部行为
随机标记50株花蕾即将开放的滇重楼植株，每天定时记录每朵花的状态，包括花是否开放，柱头干湿及开裂情况，花药散粉及运动和花粉量的变化情况；记录柱头和花药相对运动情况，柱头是否和花药接触，以此来判定滇重楼的繁殖策略。
2.2 柱头可授性及花粉活力检测
采用石蜡切片法[14]制作柱头石蜡切片，观察柱头可授部位，使用联苯胺-过氧化氢法检测柱头的可授性，并在田间观察柱头寿命。随机标记30株花蕾即将开放的滇重楼植株，从花药散粉当天起每天12：00取少量花粉采用0.5% TTC法检测花粉活力。
2.3 系统
2.3.1 杂交指数（out crossing index，OCI）的估算 按照Dafni[15]的标准进行花序直径、花朵大小和开花行为的测量及繁育系统的评判。具体方法是：①花朵或花序直径6 mm记为3；②花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔，同时或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1；③柱头与花药的空间位置，同一高度记为0，空间分离记为1。三者之和为OCI值。评判标准为：OCI=0时，繁育系统为闭花受精；OCI=1时，繁育系统为专性自交；OCI=2时，繁育系统为兼性自交；OCI=3时，繁育系统为自交亲和，有时需要传粉者；OCI=4时，繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。
2.3.2 结实率计算 于 2011年5月18日到29日，选择花期各滇重楼植株作以下处理：①蕾期套袋，待花开放后，人工辅助自花授粉；②蕾期去雄，待花开放后，人工辅助异花授粉；③不去雄套袋处理；④蕾期去雄不套袋；⑤去雄套网袋处理；⑥自然对照比较。各处理随机选择30株，挂牌标记，套袋处理试验于7月初去袋。于10月中旬收果实，并统计各处理结实率。
本试验用结果率和每果种子数表示结实率情况，由于试验过程中部分挂牌标记花朵受环境影响损失，因此结果率为各处理收获结果花数除以各处理收获的总花数，每果种子数为各处理收获种子总数除以各处理收获总花数。
2.4 传粉昆虫及花粉限制
在滇重楼的盛花期，选择晴朗天气，观察记录访花昆虫，根据其访花行为判断是否为滇重楼的有效传粉者。
选取30株盛花期植株添加异花花粉，果实成熟后统计结果率和每果种子数，并与对照比较，用自然对照的结果率或平均种子数/添加花粉的结果率或平均种子数计算传粉限制[16]。
3 结果与分析
3.1 花部行为
滇重楼单花顶生，柱头由5～8个棒状裂瓣组成。花蕾初期，裂瓣直立，紧密靠拢在一起；花朵开放时，裂瓣微张露出内侧表面；花后期，各裂瓣完全张开，增加了裂瓣内侧表面与外界的接触面积（图1）。
A. 花刚开放时，柱头裂瓣微张露出内侧表面；B. 花后期，柱头裂瓣完全张开；C. 开花早期，花药2轮排列，外轮先于内轮散粉；D. 柱头在联苯胺-过氧化氢溶液中产生气泡；E. 柱头石蜡切片，箭头示可授区。
图1 花部行为与柱头可授性及访花昆虫
Fig.1 Floral behavior， stigma receptivity and pollinators
雄蕊群基数一般为柱头裂瓣基数的2倍，蕾期雄蕊群由于萼片的包裹向中央靠拢，花开放后向外张开，形成2轮相间排列；花药一般在花开放一段时间后散粉，外轮散粉时间通常早于内轮（图1）；花药在夜间和阴雨天随着温度的下降和湿度的上升会发生周期性的闭合。
通过对大量花朵的观察统计表明（表1），开花第1天有68.17%的柱头裂瓣微外张，第2天达到82.52%，并随着花期推移，柱头裂瓣不断外张、翻卷。到第6天，97.78%柱头裂瓣均外张，且基本外张到极限。于此同时开花第1天有44%花药未散粉，23.7%的花药外轮散粉，只有32.3%花药全部散粉，第2天仍有24%花药未散粉，16.6%的花药外轮散粉，只有59%花药全部散粉，第3天有8.2%花药未散粉，10.8%的花药外轮散粉，81.0%花药全部散粉。
表1 柱头运动及花药开裂情况（n=46）
Table 1 Stigma movement and anther dehiscence observation（n=46）%
注： +示柱头裂瓣外张程度，+越多示柱头裂瓣外张越大。
推断滇重楼花早期柱头裂瓣微张、外轮花药散粉的花部行为，使自花花粉和柱头产生空间隔离，利于异交；花后期柱头裂瓣外张、花药全部散粉，拉近了花药和柱头的空间位置，利于自花传粉。
3.2 柱头可授性及花粉活力
石蜡切片观察到柱头裂瓣内表面中间有1条腹缝线，整个内表面由生长整齐的乳突细胞构成，是柱头的有效授粉区（图1）。开花当天柱头裂瓣微张露出的内表面饱满、湿润，浸苯胺-过氧化氢溶液有气泡，说明柱头开花当天就有可授性。之后几天柱头活力都很高。开花7～9 d，柱头内表面开始微干，中央腹缝线开始明显。开花10～12 d后，柱头开始干枯，渐渐失去活力（表2）。
选择开花当天散粉的植株测花粉活力，结果表明散粉时花粉便有了活力，散粉后，前2 d散粉量少，活力相对较低，平均保持在10%左右。开花3～6 d，花粉囊完全纵裂，花粉量大，粉性足，彼此黏着力强。开花 7～9 d，花药上花粉量少，花粉微干。开花10 d后花药上花粉少见。这期间，花粉活力平均保持在20%左右（表2）。
由试验可知，柱头自花开时就有了可授性，花粉自花药散粉起就有了活力，但很多植株花药需在花开后一段时间才相继开始散粉（表1），从而判断滇重楼花存在部分雌性先熟现象，成为花早期异交的另一个有利因素。表2 单花不同时期花粉活力和柱头可授性测定
Table 2 Pollen viability and stigma receptivity in different periods of the flowering
注： +.柱头具可授性； -/+.部分柱头具可授性，部分不具可授性；-.柱头不具可授性；+多少的不同示可授性强弱的不同。
3.3 系统
3.3.1 杂交指数 根据杂交指数的估算方式，滇重楼花顶端到基部30～70 mm，花直径以钟形中部为准，60～120 mm，大于6 mm，记为3；据本试验观察，滇重楼花不具有雄蕊先熟现象，记为0；花柱头和花药空间分离，记为1；由此估算出滇重楼的杂交指数（OCI）为4，按Dafni[8]的标准，可判断滇重楼的有性繁育系统为部分自交亲和，异交，需要传粉者。
3.3.2 结实率 套袋辅助自交的结果率和平均种子数分别为81.0%和20.5粒，去雄辅助异交的结果率和平均种子数分别为93.3%和40.5粒，异交结果率和种子数高于自交的结果率和种子数，由此计算出的结果率和平均种子数的自交亲和系数分别为0.87，0.51，判断滇重楼为自交亲和的植物；不去雄套袋结果率为0，说明不具备主动自交的能力；去雄不套袋结果率和平均种子数分别为12.5%和0.3，说明滇重楼自然情况下异花结果率低；去雄套网袋结果与去雄不套袋相同，推断此居群少量的异花结实主要是风媒传粉产生的；自然对照结果率和平均种子数分别为34.8%和17.3，明显高于去雄不套袋的结果率和平均种子数，结合滇重楼花不具备主动自交的能力，说明自然情况下滇重楼主要依赖自花辅助授粉结实（表3）。
表3 滇重楼不同处理的结果率和每果种子数
Table 3 The fructification rate and seed setting rate under different polination treatment
注：自交亲和系数=套袋辅助自交结果率或每果种子数/去雄辅助异交结果率或每果种子数。
3.4 传粉媒介与花粉限制
观察到偶尔有蝇类访花，但其个体小，数量少，传粉的可能性很小。另观察到很多花朵上蜘蛛在花药上吐丝结网，部分花粉在蛛丝的碰触拉动中传播到自花的柱头上。推测导致本居群自然情况下自花结实的主要原因可能就是蜘蛛吐丝结网，并且为蜘蛛辅助自花授粉结实。
自然状态下重楼花的结果率和平均每果种子数分别为34.8%和17.3粒，人工辅助异花授粉后，结果率和平均每果种子数分别提高到89.7%，41.8粒，人工辅助异花授粉每果种子数显著高于自然对照（P
4 讨论
4.1 系统界定
综合杂交指数和套袋试验的结果，判断滇重楼为混合系统，自交、异交特征并存，但不存在主动自交，需要传粉者，试验居群自然情况下主要依靠自花辅助传粉结实。
4.2 花部行为的适应意义
花作为被子植物的繁殖器官，比所有其他类群有机体的繁殖都表现出了更高的变异性[17]，以适应激烈竞争的环境。花部行为作为花高度变异性的一部分，受到人们的广泛关注。花部行为是指由外界自然环境诱导或者访问者行为诱发的花部运动，也指遗传因素控制下的花部自身的主动运动，主要包括雌蕊运动、雄蕊运动和其他花部运动[18]。花部行为在花的繁殖策略方面具有重要意义，主要集中在避免雌雄功能干扰、避免自交和实现延迟自交方面。
本研究中观察到滇重楼花早期，柱头裂瓣只微张，仅仅外轮花药散粉，使自花的花粉和柱头产生空间隔离，形成花内雌雄异位，减少了雄蕊和自花柱头的接触，避免了雌雄功能干扰，利于柱头接受外来花粉，另外笔者观察到滇重楼花存在部分雌性先熟的现象，这些都为花早期异交提供了便利。如果外界不利于异花传粉，柱头没有接受到足够的异花花粉，则花后期柱头裂瓣的外张和花药内轮散粉的花部行为，拉近了花药和柱头的空间位置，为实现辅助自花传粉创造了条件。滇重楼的这种花部行为，不仅可以保证优先通过杂交获得优势的子代，还能在传粉者缺少的情况下，通过自交实现最低的繁殖保证。相似的依靠花部行为实现异花-自花传粉策略在与滇重楼同属的北重楼和四叶重楼中均有报道，北重楼花药[10]开裂时，花粉可以依靠重力和药壁的弹力落在自花柱头上，从而实现自花传粉。四叶重楼[13]花是后期依靠柱头和花药接触从而实现主动自交的。
4.3 柱头寿命及花粉活力
植物花粉的活力和柱头寿命因环境条件不同而有很大差异。根据丁春邦[9]、王定康[19]等对四川、云南两地的滇重楼的花粉活力和柱头可授性测定结果显示，四川地区滇重楼花粉活力在2.4%～16.6%，花粉寿命大概7 d左右，云南地区测得滇重楼花粉活力在31%～96%，寿命可达23 d。本试验测定了滇重楼花期前10 d花粉活力，大概在5.5%～36%，柱头寿命大概10～12 d。笔者推测各地区完全不同的试验结果可能跟检测的方法和标准不同有关系，但主要应该是由于不同地区环境因子，包括温度、湿度和光照等不同引起的。
同时本试验观察到滇重楼花药在夜间和阴雨天随着温度的下降和湿度的上升会发生周期性闭合。花药开裂与1 d中光照强度、温度变化成正相关，与湿度成负相关，被认为是一个组织脱水的过程[20]。推测这一机制的意义在于，一方面可以保护花粉免受外界不良环境因子破坏，延长花粉活力，另一方面在不良环境条件下，传粉者也很少，花药的闭合可以节约花粉，延长花粉的散粉时间。
4.4 传粉媒介及花粉限制
重楼属植物传粉媒介研究比较有意思， Edwards[21]将重楼定义为虫媒花植物，并且认为蝇类是传粉者，崔大练[10]将北重楼定为风媒花植物，本试验中套袋试验说明滇重楼可能存在风媒传粉，同时观察到本居群可能的自花辅助传粉者是蜘蛛，以上研究揭示了重楼属植物传粉者的复杂性。从重楼属植物的花部特征看，花被绿色，整个花朵无鲜艳的颜色，花粉较多，符合风媒花的特点；单花，花药与柱头展现方式又符合虫媒花的特点。笔者推测重楼属植物传粉者媒介的多样性与其生境密切相关，重楼属植物生活在遮阴条件下，传粉者相对少，因此需要依靠多种传粉媒介实现传粉结实的目的。
笔者观察到自然条件下很多重楼居群结实率都很低，本研究通过添加外来花粉可以提高结果率和每果种子数说明试验居群滇重楼存在花粉限制，究其原因可能就是传粉者稀缺造成的。
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Breeding system of Paris polyphylla var. yunnanensis
WANG Yan-fang， LI Ge， TANG Ling， LI Rong-ying， YANG Chun-yong， PENG Jian-ming
（Institute of Medicinal Plant Development Yunnan Branch， Chinese Academy of
Medical Sciences and Peking Union Medical College， Jinghong 666100， China）
[Abstract] Objective： To provide the basic guidance for seed breeding and cross-breeding of Paris polyphylla var. yunnanensis. Method： The floral behavior and pollinators were observed； 0.5% TTC solution was used for the pollen viability test and benzidineand-H2O2 was used for estimation of the stigma receptivity. The mating systems were tested by out crossing index （OC1）， and pollination experiment was carried out by bagged and emasculated test in the field. Result： Commonly， stigma lobes spread slightly， and anthers started presenting the pollen from the outer ring while the flower was just beginning to open. Consequently， the distance between the stigma and its own pollen was relatively far， this "floral behavior" may be conducive to outcrossing. Then the flower entered the later period， while the stigma lobes spread widely， anthers all split， and this "floral behavior" shortened the stigma and its own pollen′s distance， which may be conducive to selfing. P. polyphylla was partly protogynous. Stigma life-span was about 10-12 d. After anther dehiscence， the pollen viability maintained about 10% within 2 days， and 20% within 10 days. The value of out crossing index （OC1） was 4. By pollination experiment and pollinators observed， P. polyphylla was self-compatible， but no capacity for autonomous self-fertilization； In natural circumstances， outcrossing fructification rate was low， and mainly anemophilous. Assisted selfing-fertilization fructification rate was higher， spider was the main pollinators. Conclusion： P. polyphylla has a mixed mating system with self-pollination and cross-pollination characteristics. Floral behavior has important adaptive significance in avoiding female and male interference， outcrossing， and delayed selfing. P. polyphylla is ambophily （a combination of both wind and insect pollination）， pollinators changes due to environment. Pollen limitation is the main cause of low fructification rate under natural conditions.
[Key words] floral behavior； protandrous； mating system； pollinators； pollen limitation
doi：10.4268/cjcmm20131707