氨基酸手性拆分研究进展
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摘要：氨基酸广泛应用于医药、食品及化妆品等行业。大多数氨基酸含有手性中心，存在D型和L型对映异构体。这两种异构体的生理作用多数情况下是不同或完全相反的。人工合成的氨基酸大多为外消旋体，必须手性拆分。本文综合国内外最新研究成果，对氨基酸拆分技术做了较系统综述。
关键词：氨基酸；手性拆分；研究进展
中图分类号：Q517 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0060-05
氨基酸是组成蛋白质的基本单元，广泛用于医药食品及化妆品等行业。大多数氨基酸含有手性中心，存在生理活性不相同的D型和L型两种对映异构体。其中，L-氨基酸能被人体直接利用，D-氨基酸则须在体内转化为L型后才被吸收利用。不同种类的D-氨基酸，其在体内转化的数量及程度是有差异的，如果超过该种氨基酸的转化极限就会引起D-氨基酸中毒。人工合成氨基酸多为外消旋氨基酸，如何高效获得高光学纯的氨基酸对映异构体对生产相关药品及食品具有重要意义。本文从化学拆分法、手性膜拆分法、色谱拆分法，酶拆分法、诱导结晶法和提取拆分法等综述氨基酸拆分技术的最新进展。
1.化学拆分法
化学拆分法是研究最早的用于拆分光学异构体的方法之一，其机制、工艺最为成熟，多年来一直被企业广泛采用并批量生产。氨基酸的化学拆分原理如下：将外消旋氨基酸与拆分剂作用生成两种非对映异构体的氨基酸衍生物(如氨基酯，酰胺或盐)，利用非对映体物理化学性质的差异(通常为溶解度差异)分离，最后除去拆分剂，分别获得D-氨基酸和L-氨基酸。
化学拆分法中，拆分剂的选择是影响拆分收率及产品光学纯度的重要因素。目前常用于外消旋氨基酸的拆分剂有酒石酸、樟脑磺酸、扁桃酸及其衍生物等。如Yamada等用D-3，溴化樟脑磺酸(D-3-bromocamphor-8-sulfonicacid，D-BCS)作为拆分剂，拆分(d1)-对羟基苯甘氨酸，通过酸碱调节pH值，在pH 4.0时析出D-对羟基苯甘氨酸，收率可达92％。程菲利用D-二对甲基苯甲酰酒石酸拆分(d1)-苯丙氨酸、(d1)-对氯苯丙氨酸和(d1)-对溴苯丙氨酸，得到的D-型产物产率均可达85％以上，光学纯度达90％以上。Yoshioka等用(S)-(-)-1-苯乙磺酸作拆分剂，在乙腈溶液中与(d1)-缬氨酸形成非对映体盐，拆分得到D-缬氨酸，拆分收率70％，光学纯度90％。李叶芝等以新型拆分剂R-四氢噻唑2-硫酮-4-羧酸[R-(-)thiazolidine-2-thione-4-carboxylicacid，(R)-(-)-TTCA]手性拆分多种(d1)-氨基酸酯，得到(R)-TTCA-氨基酸酯盐及光学活性氨基酸酯，其光学纯度为35.4％-75.8％，同时通过水解(R)-TTCA-氨基酸酯盐得到另一种对映体，光学纯度为39.50％-69.10％。化学拆分法作为最常用的拆分方法，其局限性也较明显，如拆分剂和溶剂的选择较盲目，拆分的产率和产品的旋光纯度不高，适用于手性拆分的氨基酸的种类不多等。近年，随着主一客体化学的深入研究开发的包结拆分法在一定程度上弥补了经典成盐拆分法的不足。包结拆分法的基本原理是利用手性的主体分子(host molecule]通过弱分子间的作用力，如氢键或分子间π-π作用力，选择性地与外消旋客体分子(guest molecule)中的一个对映异构体形成稳定的超分子配合物(包结复合物，inclusion complex)而析出，达到使对映异构体分离的目的，如图2所示。吴划方利用(R)-1，1’-联二萘酚包结拆分链状L-氨基酸的N-手性季铵盐，得到两种对映异构体的比例约为1.58：1，拆分效果较好。
2.膜拆分法
膜拆分法即膜分离法，其机制类似于采用手性配体交换色谱法拆分外消旋氨基酸，主要依赖氨基酸对映异构体与溶液中的金属阳离子及载有手性选择体的固定相形成三元配合物的稳定性差异。通常L-氨基酸形成的配合物比D-氨基酸稳定，故可将待拆分的氨基酸外消旋体选择性地吸附于手性渗透膜上，然后脱吸附，通过浓度差驱动将被吸附的氨基酸扩散至溶液中。根据拆分膜的状态，可分为固体膜拆分和液膜拆分两种。
液膜拆分法是利用液膜对氨基酸的某一对映异构体有比其他对映体更强的亲和力，基于选择性提取的原理达到拆分外消旋体的目的。液膜可分为支撑液膜(supported liquid membrane，SLM)、厚体液膜(bulkliquid membrane，BLM)和乳化液膜(emulsified liquidmembrane，ELM)。
Breccia等在BLM膜的U型管单元中以胍盐为选择剂，拆分(d1)-色氨酸和(d1)-苯丙氨酸，光学收率可达80％。Pickering等用乳液膜选择性地分离苯丙氨酸，用铜(II)-N-癸-1-羟脯氨酸作手性选择剂，最佳拆分因子为2.4。龙远德等制备了一种新型的以L-脯氨酸为手性选择子的透过膜，考察了对(d1)-酪氨酸，(d1)-苯丙氨酸和(d1)-色氨酸的拆分，光学收率分别为40％，30％和50％。
固体膜拆分法是基于液膜的不稳定性发展起来的，用于外消旋氨基酸拆分的手性固体膜种类很多，总体上可以分为天然高分子膜和合成高分子膜两类。
Maruyama制备了有两亲性侧链的a-螺旋链聚氨基酸衍生物作为手性膜材料，利用这种膜成功地拆分了酪氨酸和色氨酸。Kim等最近用海藻酸钠和脱乙酰壳多糖分别与戊二醛交联生成的复合物作为膜材料，拆分外消旋的色氨酸和酪氨酸，光学纯度达98％以上。Bmggemann等以聚丙烯膜孔内的聚合物作为分子识别位点，用这种分子印迹聚合物膜拆分N-苄氧羰基-(d1)-酪氨酸外消旋体，发现N-苄氧羰基L-CBZ-酪氨酸的扩散通过膜的速度大于N-苄氧羰基D-酪氨酸，达到手性拆分的目的。王晶石等用由B-环糊精、聚丙烯酸和聚乙烯醇构成的手性阳离子交换膜分离(d1)-苯甘氨酸，其中D-苯甘氨酸优先通过该交换膜从而起到分离效果，膜的分离系数1.20左右。
3.色谱拆分法
色谱法的拆分原理：溶于流动相的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到拆分的效果。色谱拆分法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、手性配体交换色谱法(LEC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳色谱法(HPCE)及超临界流体色谱法(SFC)等。由于色谱法具有高效能、选择性好、灵敏度高、操作简单等特点，成为发展最快、研究最多的一种方法。就氨基酸手性拆分研究而言目前应用较多的主要是HPLC和HPCE拆分法。
HPLC拆分法一般分为直接法和间接法。采用间接法时，对映体首先与光学纯手性化合物进行化学反应生成一
对非对映立体异构体，然后再分离，也称柱前衍生化法或手性衍生化试剂法。直接法则不需要做柱前衍生化处理，直接以手性固定相或手性流动相拆分，直接法的分离原理是手性对映体之一与手性固定相或流动相添加剂间发生分子间的三点作用，形成稳定络合物，另一对映体仅发生两点作用，形成不稳定的络合物，通过手性流动相的洗脱使两个对映异构体分离。
Davank04161首次将L-脯氨酸键合到聚苯乙烯树脂上作为手性选择子，引入铜离子形成铜离子配合物，第一次实现液相色谱完全分离对映异构体，证明了配体交换色谱的实际应用价值。李元宰等利用HPLC，用多糖类手性固定相Chiralcel OD柱分离一系列a-氨基酸的邻苯二甲酰衍生物对映体，拆分效果良好(a=1.34-2.11)，而且全部得到了基线拆分。陈峰等利用Baseline LEC-L10为手性固定相的配体交换色谱法手性分离合成6种消旋B-苯丙氨酸，得到了满意的拆分色谱图，基本达到基线分离。黄可辛等用L-a-三氟乙酰氧基丙酰氯经GC拆分(d1)-缬氨酸、(d1)-亮氨酸和(d1)-蛋氨酸，分离度分别为1.50，1.11和2.01，获得了较好的拆分效果。黄宝美等用高效毛细管电泳电导法拆分苯丙氨酸对映体，分离度可达2.9，实现了基线分离。
4.酶拆分法
外消旋体中的两种对映体，其中一个对映体可在酶的作用下转化成其他物质，另一个则不变化，从而实现对映体拆分，这种拆分法称为酶拆分法。
酶法拆分氨基酸主要有两种反应方式：一是酶反应中消耗掉某种氨基酸的衍生物(通常是N-酰化氨基酸或酯化氨基酸)，使两种手性异构体分离；另一种是先使手性氨基酸异构体衍生，并使其中一种衍生物在酶作用下与其他试剂发生反应，另一种则不反应，从而实现分离。
王春生等利用猪肾氨基酰化酶实现了乙酰-(d1)-丙氨酸拆分，得到的L-丙氨酸的实际产率可达70％左右，拆分效果较好。钱绍松等研究(d1)-茶氨酸经乙酰化生成(d1)-N-乙酰基茶氨酸，然后利用米曲霉氨基酰化酶拆分(d1)-N-乙酰基茶氨酸得L-茶氨酸，收率85％，光学纯度为98％。何平等利用木瓜蛋白酶及固定化木瓜蛋白酶拆分(d1)-苯丙氨酸，拆分得L-苯丙氨酸的产率为59.2％，光学纯度为96.6％。黄冠华等在固定化青霉素酰化酶(IPA-750)存在下，通过N-苯乙酰-(d1)-苯丙氨酸的选择性水解完成了酶法拆分(d1)-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸的过程，收率67％，光学纯度达到91％。
5.提取拆分法
提取拆分法是利用溶质在两种互不相溶的溶剂相中溶解度的差异提取拆分，该方法具有提取与分离效率高、分离效果好、需要设备简单等优点，且均在常压、常温下提取，能耗低。理论上，两个对映体的分离因数大于1，则在足够多的级数下，可实现对映体高纯度分离。目前的研究结果表明，提取过程的分离因数可达2.5以上，因而只要不多的理论级数即可实现较好分离。根据拆分体系不同，提取拆分法可分为：亲和提取拆分法、配位提取拆分法和形成非对映异构体的提取拆分法。
Pickering等以正癸基-L-羟脯氨酸的Cu(II)络合物作拆分剂成功地拆分了苯丙氨酸对映体，得到L-苯丙氨酸的平衡分离常数为0.149±0.002，D-苯丙氨酸的平常分离常数为0.228±0.002。Tsukube等以镧系元素为中心离子(镱、镨、铑等)，B-双酮为配体所形成的配合物作提取拆分剂，二氯甲烷作稀释剂，提取拆分了水溶液中的苯基甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等一系列氨基酸。崔玉等利用提取剂正辛基-L-羟基脯氨酸提取苯丙氨酸，发现提取剂对(d1)-型氨基酸均具有良好的提取作用，对映体分离系数可达到2。
上述研究结果表明，新型提取拆分剂的开发与选择对于获取高效分离和较好的经济效益至关重要，但目前尚未见可用于工业生产的拆分提取剂报道，因此，从拆分提取剂的结构与性能的关系入手探求研制新的高效拆分提取剂可能是推进提取拆分法工业化的有效途径。
6.诱导结晶法
诱导结晶法是利用氨基酸的某一旋光异构体在一定温度时较外消旋体溶解度小，易析出的性质，在外消旋体溶液中加入某种旋光异构体作为晶种，诱使与晶种相同的异构体优先析出，借此达到分离目的。
Kojo等用结晶法成功拆分了(d1)-天冬氨酸；殷树梅等以水为溶剂，取代芳磺酸为拆分剂，用诱导结晶法，经成盐、拆分和水解过程，成功拆分(d1)-对羟基苯甘氨酸，获得D-对羟基苯甘氨酸。
7.小结
随着社会的发展，人们对氨基酸的需求量将越来越大。就氨基酸的手性拆分而言，化学拆分法是经典有效的拆分手段，需要的设备不多且操作简便，发展至今仍为获得手性氨基酸的基本方法，广泛用于工业生产。膜分离是一种节能技术，从连续性和能量有效的观点出发，通过手性膜拆分是很有应用前景的拆分手段。酶法具有拆分效率高、立体选择性高、反应条件温和、专一性强、操作简单和有利于环保等优点，使它在工业生产中具有很好的应用前景。色谱拆分法目前国内只是用于实验室的小量拆分，国外的模拟流动床色谱技术的成功应用，使运用色谱拆分法实现大量制备手性物质成为可能。提取拆分技术适用性强、便于连续拆分有望成为外消旋体拆分分离操作的先进技术。总之，能耗低、效率高、简便环保的拆分法是未来氨基酸拆分技术的主要发展重点。