宫内感染免疫失败的幼儿及母亲HBVS基因检测分析
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇宫内感染免疫失败的幼儿及母亲HBVS基因检测分析范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
王翠敏 韩国荣
[摘要]目的通过对乙型肝炎病毒宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲体内hbvs基因进行序列分析，探讨HBVs基因变异、基因型与免疫失败的关系。方法选择2000年1月－2005年10月东南大学附属南京第二医院出生的17例HBV宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲，采用ELISA法检测血清HBVm，PCR实时荧光定量法检测HBV-DNA，PCR扩增HBVs基因序列，以引物标记法测序，全自动基因测序仪分析结果。结果17例HBV宫内感染免疫失败幼儿及其母亲均未发现有s基因变异，免疫失败幼儿的基因序列和母亲的基因序列基本相同，且母婴基因型皆为c型adr亚型。结论宫内感染免疫失败与HBVS区是否基因变异无关；母婴序列具有高度的同源性；基因c型母亲所生婴儿可能更容易发生免疫失败。
[关键词]肝炎病毒，乙型；宫内感染；免疫失败；s基因；基因变异
母婴传播是乙型肝炎病毒(HBV)重要的感染途径之一，我国的慢性HBV感染者约有30％－50％是母婴传播所致。虽然乙型肝炎疫苗和乙型肝炎高效价免疫球蛋白(HBIG)的联合应用使母婴传播的危险性大为降低，但仍有5％－10％的婴幼儿免疫失败，这些免疫失败的婴幼儿几乎全部为宫内感染所致。
目前关于宫内感染免疫失败的原因尚不清楚，母亲高滴度病毒携带及幼儿对疫苗反应性低都是免疫失败的原因。有研究表明，HBVs基因变异可使病毒逃避宿主体内的免疫应答，从而增加免疫失败的发生率。我们对17例HBV宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲所感染HBV的S基因进行检测，分析宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲所感染HBV的s基因变异发生率，探讨s基因变异、基因型与宫内感染免疫失败的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
选择2000年1月至2005年10月在东南大学附属南京第二医院产科出生并且跟踪随访的幼儿及母亲，17例幼儿(男10例，女7例)及其母亲乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及核心抗体(抗HBe)均为阳性(俗称“大三阳”)，HBV-DNA定量值均在106拷贝・ml-1以上。幼儿均符合宫内感染免疫失败的诊断：即出生至1个月HBsAg持续阳性，判为宫内感染；出生后按程序行主、被动联合免疫，至12月龄时HBsAg持续阳性，抗HBs阴性判为宫内感染免疫失败。排除早产儿、低出生体重儿及出生时有窒息史、先天性疾病和合并其他感染性疾病史者。父亲为正常无HBsAg携带人群，幼儿均人工喂养，避免与母亲有血液、体液的接触。
1.2 检测方法和试剂
于幼儿股静脉及母亲肘静脉各取血4ml，分离血清置－20度备用。血清HBVm采用美国Abbott酶联免疫试剂，ELISA法检测。HBV-DNA定量采用PCR实时荧光定量检测系统检测，试剂由深圳匹基公司提供。HBV’DNA提取试剂盒为QIAamp DNA Mini Kit(德国QIAGEN公司)，提取步骤参照说明书。
1.3 引物设计
所有引物均用引物设计软件Primer Primer 5.0设计，由上海生工生物工程公司合成。外引物为P1OS、P1OA-S，扩增片断为835bp，内引物为P1IS、P1IA-S，扩增片断为791bp。测序用引物采用M13通用正反向引物，在上述内引物5'端加M13正反向序列。引物序列具体。
1.4 HBVS基因扩增
Taq酶由宝生物TaKaRa公司提供。用血清标本提取的HBV DNA作为模板，分别用引物P1Os、P1OA。s、P1Is、P1IA-S扩增。反应条件如下：20μl反应体系中包括引物各6pmol、dNTP(2.5mmol・L-1)1.6μl、MgCl2(25mmol・L-1)1.8μl或1.4μl、10×Buffer1μl、TaqDNA酶(5U・μl-1)0.l、模板12.5μl或模板8μl+H2O4.5μl。反应程序为首轮变性94度3min，中间循环94度45s、50度或55度30s、72度50s循环30次，末次延伸7度25min。阳性DNA模板用PlOS、P1OA-S、M3+P1IS、M13+P1IA-S重新扩增，反应程序同上。先用内引物扩增，阴性者再用套式扩增。PCR结束后，取5μlPCR产物电泳，Marker为DL2000(宝生物TaKaRa公司)5μl。电泳阳性模板取5μl用微量核酸定量仪测量浓度及纯度。
1.5 测序反应
测序试剂盒由美国USB公司生产，测序仪为美国Li-。Cor公司产品。反应体系中模板加入量根据PCR产物浓度而定。测序引物用M13通用引物(已标记)，上游片断用M13正向序列，下游片断用M13反向序列，测序反应程序分别为92度3min,92度30s、53地45s,72度45s循环30次。测序反应结束后加反应终止液，上样电泳9h。测序结果同GenBank中HBV标准株比对，分析基因序列。
1.6 重新设计引物
外引物为P2OS、P2OA-S，扩增片断为390bp；内引物为P2IS、P2IA-S，扩增片断为228bp。反应液与反应循环基本同上，重新扩增“a”决定簇区，复测此区基因序列，进一步鉴定该区基因所测序列的正确性。引物序列具体。
2 结果
将17例HBV宫内感染免疫失败幼儿及其母亲HBV S基因核苷酸序列的测定结果与GenBank中标准株比对并行核苷酸序列分析，结果显示s区均无变异基因发现；对功能区“a”决定簇区用不同引物重复测定结果相同。另外，宫内感染免疫失败的幼儿与其母亲的基因序列具有高度相似性，仅个别核苷酸不同，未引起氨基酸的改变，属于同义突变。
所测S基因序列与GenBank中不同基因型HBV的S基因序列比较，根据相同基因型间异质性
3 讨论
目前使用的血源性或基因工程疫苗仅含有S基因产物，因此，如果病毒变异可能引起疫苗保护失败，那么该病毒的变异位点应该位于S区。s区G145R突变
被认为是一个典型的免疫逃离突变。该位点位于“a”决定簇区，它的突变使HBV不能被中和抗体识别，因此HBIG和乙肝疫苗难以阻断该突变株的母婴传播。我们对17例常规免疫后宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲携带的HBV的s基因进行序列分析，并没有发现s区基因变异现象，“a”决定簇表位没有突变，与免疫逃避有关的突变位点也未发现，说明就本研究而言，免疫失败与HBV S区是否基因变异无关，免疫失败有其他起决定作用的因素。
随着诊治水平的提高和HBIG与乙肝疫苗程序化接种的普及，新近免疫失败的婴幼儿几乎均为宫内感染所致。关于HBV宫内感染危险因素的研究结果不尽一致，但较为肯定的危险因素有孕妇外周血HBeAg阳性、HBV DNA高滴度、先兆早产和胎盘绒毛毛细血管内皮HBV感染。Wang等研究发现，孕妇的HBV DNA水平与婴儿HBIG和乙肝疫苗的免疫失败关系密切，母亲体内HBV DNA水平越高，婴儿免疫失败的发生率就越高。本研究中免疫失败幼儿的母亲体内HBVDNA水平均在106拷贝・ml-1以上；免疫失败幼儿的基因序列和母亲的基因序列具有高度相似性，而且具有同源性，进化关系也很接近。说明孕妇体内HBV通过胎盘进入胎儿体内，并在胎儿体内复制，导致宫内感染的发生，进而导致免疫失败。据文献报道，当母亲体内HBV-DNA水平大于1.2×109拷贝・ml-1时，其所生新生儿约有30％在出生1年之内HBsAg持续阳性，因此，降低母亲血液中病毒含量可有望减少宫内感染及免疫失败的发生。另外，孟金来等认为，宫内感染HBV并侵犯外周血单核细胞(PBMC)是新生儿免疫失败的重要原因，HBV侵犯PBMC，使IL-2分泌能力下降，可能导致新生儿免疫接种失败。
目前认为，HBV共有A-H 8个基因型，其分布具有地区性。中国地区的流行株主要为B型和c型。既往统计显示北方以c型为主，南方以B型为主。王继杰等认为，HBsAg的“a”决定簇氨基酸变异的危险程度与病毒的基因型和血清型有明显关系，基因型B和adw2血清亚型携带者受免疫后出现基因变异的OR值分别为31.7和28.9，而基因型C和adr血清型的OR值仅为1.3和0.9。本次研究标本S区未见突变可能与所属型别有关，即所检标本基因型皆为C型，血清型皆为adr亚型。虽然所选标本带有一定的偶然性．但是否可以说明同样病毒携带量的情况下，基因c型母亲所生的婴儿容易发生宫内感染免疫失败，这有待于扩大样本及增加对照作进一步研究。