肝素酶siRNA联合亚砷酸抑制胰腺癌侵袭性的实验研究
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摘 要：目的：观察Hpa小干扰RNA（small-interfering RNA, siRNA）联合亚砷酸对胰腺癌侵袭力的影响，为Hpa-siRNA联合亚砷酸治疗胰腺癌提供实验依据。方法：将3条Hpa干扰靶序列Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA稀释退火，分别与线性化pGenesil-1.1 质粒表达载体的连接制成pGenesil1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil1.1/Hpa3-siRNA等重组质粒。然后将上述目的基因转染SW1990胰腺癌细胞，并设空白对照和阴性对照组。RT-PCR检测转染后Hpa-mRNA表达，Western blot检测转染后Hpa蛋白表达。采用Transwell小室试验检测转染后Hpa-siRNA和经亚砷酸处理SW1990细胞体外侵袭能力。结果：Hpa-mRNA和Hpa蛋白在基因转染前后的表达，NC和HK组无明显差别，Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA三组均明显下降，Hpa2-siRNA抑制效率优于Hpa1-siRNA和Hpa3-siRNA（P
关键词：乙酰肝素酶；小片段干扰RNA；亚砷酸；胰腺癌，侵袭力
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2657-05
Research on Heparanase sirna Combined with Arsenous Acid
Inhibiting Invasion of Pancreatic Cancer Cells in Vitro
ZHENG Jiaping1,2,YANG JianMin3,Ru QingJing1
(1.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hanghzou 310053,Zhejiang,China;
2.Zhejiang Tumor Hospital,Hangzhou 310022,Zhejiang,China;
3.Zhejiang People's Hospital,Hangzhou 310014,Zhejiang,China)
Abstract:Objective：To observe invasion inhibiting effect of Hpa small-interfering RNA (siRNA) combined with arsenous acid on pancreatic cancer cells, so as to provide the theoretical foundation for further clinical use in the cancer treatment. Methods：Target gene (Hpa1-siRNA，Hpa2-siRNA，Hpa3-siRNA) fragments were diluted, annealed and connected with linear plasmid expression vector pGenesil-1.1, then pGenesil1.1/Hpa1-siRNA, pGenesil1.1/Hpa2-siRNA and pGenesil1. 1/Hpa3-siRNA were reconstructed. The Hpa-siRNA was transfected into SW1990 pancreatic cancer cell by DOTAP Liposomes meanwhile the empty control and negative control group were designed. Those target genes were respectively transfected into Hpa-mRNA and Hpa protein expression was detected by RT-PCR and Western blot respectively. Transwell cab model was employed to test the ability of SW1990 cell. Results： Expression of Hpa-mRNA and Hpa-protein in SW1990 were obviously suppressed by Hpa1-siRNA, Hpa2-siRNA, and Hpa3-siRNA, and efficacy in Hpa2-siRNA better than in Hpa1-siRNA and Hpa3-siRNA（P
Key words:Hparinase; small interfering RNA; arsenous acid; pancreatic cancer；invasive ability
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收稿日期：2011-07-19
基金项目：浙江省研究生创新科研资助项目(YK2008071)
作者简介：郑家平（1972-），男，浙江杭州人，博士研究生，研究方向：中西医结合防治肿瘤。胰腺癌的发病率占恶性肿瘤的1%~5%，近年来在世界范围内有明显增多的趋势，传统的治疗手段是手术切除为主，联合放疗和化学药物治疗。其五年生存率低于5%，超过90%患者在确诊后1年内死亡，平均存活期少于6月\[1\]。胰腺癌高度侵袭、转移的生物学特性是其预后不良的关键。因此，积极探索和阐明胰腺癌侵袭转移的分子机制，寻求有效抗侵袭、抗转移的治疗措施对改善预后具有重要意义。最近研究表明，Hpa高表达可促进胰腺癌的增殖、侵袭和转移，直接影响胰腺癌患者预后和生存时间\[2-6\]。
因此，Hpa基因有望成为胰腺癌生物治疗的新靶点。另外，一些研究发现\[7-12\]，亚砷酸对多种恶性肿瘤的侵袭和转移性尚具有明显抑制作用。因此我们观察Hpa-siRNA联合亚砷酸对胰腺癌侵袭联合抑制效果。从而为将来亚砷酸联合Hpa-siRNA治疗胰腺癌患者提供理论基础和实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
pGenesil-1.1质粒和大肠杆菌DH5α菌株由武汉晶赛生物有限公司构建和制备。胰腺癌SW1990细胞株购自中国科学院上海细胞库。亚砷酸冻干粉（10mg/支）由北京双鹭药业股份有限公司馈赠。Hpa基因序列自行设计，序列为：Hpa-F 5'- GAAAGACGGCTAAGATGC -3' Hpa-R5'- AAATGGTAGTTTCCTGCTC -3' 扩增片段大小为361bp。GAPDH452内参引物为：序列为GAPDH452-F 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' GAPDH452-R 5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' 扩增片段大小为452bp。紫外分光光度计（SHIMADZU），DNA Marker、Eco31I内切酶、SacI内切酶和T4DNA Ligase链接酶(TaKaRa)， 质粒小抽试剂盒（北京博大泰恒生物技术有限公司），水平电泳仪 DYY-III（北京六一仪器厂），胶回收试剂盒（北京博大泰恒生物技术有限公司），动物RNAout（天泽基因工程有限公司产品），ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit （东洋纺上海生物科技有限公司），PCR引物（武汉博洁公司），PCR system 2700(美国AB公司GenAmp)，Taq DNA 聚合酶（MBI 公司），HRP标记的羊抗兔IgG和 Rabbit anti-Hpa抗体（武汉三鹰），Rabbit anti-GAPDH多克隆抗体（武汉晶赛），PVDF膜（Life Science, USA），SuperSignal化学发光试剂（Pierce, USA），Transwell小室(CORNING)。
[WT5”FZ〗中华中医药 学刊
1.2 方法
1.2.1 目的基因设计、合成、与质粒连接、酶切 通过Pubmed网站搜索目的基因人肝素酶mRNA序列，并确定基因号为NM_001098540（1779 bp）或NM_006665（1810 bp）为本实验的目的基因。委托武汉晶赛生物有限公司设计挑选3条靶序列和干扰序列dsDNA模板引物，分别命名为Hpa1、Hpa2、Hpa3，引物结构：CACC+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SacI。用30μL annealing buffer 溶解上述合成1OD Hpa1/Hpa2/Hpa3单链目的基因片段。取2μL（即2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3A +2μL Hpa1/Hpa2/Hpa3-B）+16μL annealing buffer混匀。94℃水浴退火自然冷却至室温。取1μL退火产物+99μL H2O做100倍稀释。将稀释退火片段分别与线性化载体pGenesil-1.1的连接，分别命名为pGenesil-1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil-1.1/Hpa3-siRNA。各取5μL过夜连接产物转化感受态细胞DH5α，分别涂布于含卡那霉素抗性（终浓度为30μg/mL）的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取单克隆菌落接种于3mL含卡那霉素抗性（终浓度为30μg/mL）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用小提试剂盒小量提取质粒，并分别用SacI做酶切鉴定。
1.2.2 RT-PCR检测Hpa-mRNA表达 将NC（空白质粒组）、Hpa1-siRNA、Hpa2-siRNA、Hpa3-siRNA质粒载体、HK（无特异性Hpa-siRNA质粒阴性对照组）采用DOTAP脂质体法转染SW1990胰腺癌细胞48h。取转染后继续培养48 h的S W1990细胞，以TRIzol法提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书步骤进行实验。cDNA反应系统见表1～2，第一步反应条件：75℃ 5min，短暂离心后置于冰上。第二步反应条件：42℃ 60min, 95℃ 5min。将合成好的cDNA 第一链放置-20℃保存。取上述合成cDNA 第一链为模板，进行PCR扩增获得361bp的Hpa基因片段，反应体系见表3。将上述反应体系置PCR扩增仪上 95℃变性5min，然后开始PCR循环：95℃ 25s50.0℃ 25s72℃ 22s，共35个循环，72℃延长3min，4℃保存。DNA电泳观察鉴定：取200μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，用DL2000 Marker作DNA分子量标准带，溴乙锭染色，紫外透射仪上观察并照相。如出现361bp 的电泳带，则为Hpa
2.4 亚砷酸联合Hpa-siRNA对SW1990胰腺癌细胞侵袭力的影响
见表5，见插页Ⅴ图6。
随着亚砷酸浓度从0.5，1.0，2.0mg/mL的递增，侵袭抑制率升高，分别为：7.78%、46.8%、76.8%，差异有统计学意义（χ2=71.633，P
胰腺癌高度侵袭、转移的生物学特性是其预后不良的关键。因此，积极探索和阐明胰腺癌侵袭转移的分子机制，寻求有效的抗侵袭、抗转移治疗措施对改善预后具有重要意义。最近研究表明，Hpa高表达可促进胰腺癌的增殖、侵袭和转移，对胰腺癌患者预后和生存时间有重要的影响\[2-6\]。因此，Hpa基因有望成为胰腺癌生物治疗的新靶点。我们的研究拟通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术沉默Hpa基因，观察对胰腺癌侵袭性的影响。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指外源双链RNA ( double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞后，能特异性的诱导同源互补的mRNA降解，导致转录后水平基因表达沉默现象。RNAi作为一种沉默基因表达的新技术，能特异、有效的抑制靶基因的表达，已被广泛的应用于基因功能研究、病毒感染和肿瘤的基因治疗等领域。针对肿瘤发生发展过程中起关键作用的癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子、受体表达基因以及侵袭转移相关基因等，利用RNAi沉默靶基因的表达，可以抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡、增加药物敏感性、抑制血管生成、侵袭、转移等作用，为肿瘤治疗开辟了新的途径。小干扰RNA ( small-interfering RNA, siRNA)作为RNAi效应分子，是RNAi作用的主要介质。它呈发夹状结构，是一段长度约为21-23核苷酸的小双链RNA，经核酸酶降解mRNA而阻断其编码蛋白质的表达，即通过RNAi实现基因沉默\[7\]。
到目前为止，尚不清楚利用RNAi技术是否靶向沉默Hpa表达进而抑制胰腺癌侵袭性。因此，我们进行探索性研究，首先我们自行设计合成Hp-siRNA，利用质粒pGenesil-1.1作为载体有效转染SW1990胰腺癌细胞，进一步检测转染pGenesil-1.1-Hpa-siRNA质粒后SW1990胰腺癌细胞的Hpa蛋白和mRNA的表达，结果表明转染pGenesil-1.1-Hpa-siRNA质粒表达载体（含Hpa1，Hpa2，Hpa3三条干扰序列）的SW1990胰腺癌细胞蛋白和mRNA表达明显降低，其中Hpa2抑制效果优于Hpa1，Hpa3，具有统计学差异，P＜0.05。NC和HK组Hpa-mRNA和蛋白的表达无明显变化。因此，我们研究认为，Hpa2可靶向沉默Hpa基因的表达，且是特异性最高的Hpa-siRNA。另外，我们的研究结果提示Hpa基因还没有达到完全沉默，可能是由于Hpa-siRNA只能抑制Hpa基因表达，而不是敲除该基因。因此单纯siRNA疗效有限，需要联合其他有效的治疗手段。
三氧化二砷 ( Arsenic trioxide,As2O3 ) 俗称砒霜，人类用它治疗疾病已有 2400 年的历史。我国著名血液学专家陈竺等将三氧化二砷用于急性早幼粒细胞白血病的治疗,研究发现其通过诱导白血病细胞分化和凋亡从而发挥抗肿瘤作用\[8\],开创了恶性肿瘤治疗的新纪元。
随着人们对As2O3 的作用机理和适应证方面的衍生研究, 相继发现其对多种实体瘤有抑制作用\[9\]，多项体外研究结果显示可能的抑癌机制是通过多种途径、多种机制如阻滞细胞周期、激活Caspase以及改变GA DD的表达，抑制 surviving、 bcl-2 基因表达，增加Fas、Fas-L表达抑制肿瘤细胞增殖促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥其抗胰腺癌的作用\[10-15\]。
体内实验进一步验证三氧化二砷组移植瘤体积和质量均显著低于模型组，三氧化二砷具有抑制人胰腺肿瘤形成和生长的作用，且具有剂量依赖性，联合紫杉醇具有协同作用\[16-17\]。
近年来人们发现三氧化二砷有抑制软组织肉瘤\[17\]、鼻咽癌\[18\]、胶质瘤\[19\]、宫颈癌\[20\]、肺癌\[21\]、胰腺癌\[22-23\]多种恶性肿瘤侵袭转移作用，可能机制与抑制MAPK信号通路或者下调转移相关基因如MMP-2、MMP-9、CD44、nm23的表达有关。另外人们还发现中药三氧化二砷 ( Arsenic trioxide,As2O3 )通过多种机制、途径抑制胰腺癌的侵袭力，因此我们尝试将Hpa-siRNA技术结合三氧化二砷，探讨两者的协同作用。
我们通过不同浓度梯度的亚砷酸进行体外细胞试验，结果表明，亚砷酸具有抑制胰腺癌侵袭力的作用，随着亚砷酸浓度从0.5，1.0，2.0mg/mL的递增，侵袭抑制率升高，分别为7.78%、46.8%及76.8%，差异有统计学意义（χ2=71.633，P
但是，上述实验结果需要将来在体内实验进一步验证。另外尚有待于进一步研究揭示两者协同放大作用的分子机制。
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