依达拉奉对大鼠癫痫持续状态神经元细胞凋亡的影响

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摘要：目的研究自由基清除剂依达拉奉对大鼠癫痫持续状态（SE）后神经元细胞凋亡的影响。方法采用氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型，实验Wistar大鼠随机分为实验组（72只）和对照组(C组，6只），实验组分为模型组（M组）、依达拉奉单药治疗组(ED组)、联合地西泮治疗组（ED+DI），每组按照时间点分为4个亚组（12 h、24 h、72 h、7 d）。免疫组化法检测大鼠脑组织的Bcl-2蛋白表达,及TUNEL法检测细胞凋亡的情况。结果Bcl-2蛋白表达与对照组相比，M组12 h达高峰，24 h开始减少， 7 d减至基础水平（P

关键词：依达拉奉 癫痫持续状态 Bcl-2 神经元凋亡

中图分类号：R742.1R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0585-02

本实验拟采用依达拉奉及与地西泮联合治疗观察其对癫痫持续状态神经元细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1材料清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体重200 g～250 g，由山西医科大学生理教研室动物中心提供；氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司;匹罗卡品购自美国Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒均系武汉博士德公司产品;DAB试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司出品;依达拉奉系江苏南京先声药业有限公司生产。

1.2方法

1.2.1动物分组78只Wistar大鼠随机分为实验组（72只）和对照组（C组，6只），实验组分为模型组（M组）、依达拉奉单药治疗组(ED组)、联合地西泮治疗组（ED+DI），每组按照时间点分为4个亚组（12 h、24 h、72 h、7 d）。实验动物饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。

1.2.2动物模型制备氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型制作,腹腔注射氯化锂3 mEq/kg，20 h后再腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30 mg/kg。对照组大鼠给予生理盐水腹腔注射。大鼠在15 min~45 min出现反复强直-阵挛发作，形成癫痫持续状态。按照经典的Racine癫痫发作行为标准进行癫痫行为观察记录。实验组动物发作级别均达到Ⅳ级～Ⅴ级以上提示造模成功。干预组大鼠在癫痫发作后1 h腹腔注射依达拉奉20 mg/kg，联合治疗组同时腹腔注射地西泮10 mg/kg，随机分为按照发作后12 h、24 h、72 h、7 d再分为实验组4个亚组。

1.3标本采集与处理实验组大鼠分别在癫痫持续状态发作后12 h、24 h、72 h、7 d与对照组大鼠，用5％水合氯醛按5 ml/kg腹腔注射麻醉,断头取脑。大鼠脑组织在4％的多聚甲醛中固定24 h，经石蜡包埋后，在海马部位作矢状位切片，片厚约5μm。HE染色,光镜下观察形态学变化。

1.3.1Bcl-2蛋白免疫组化染色按照常规SABC法进行免疫组化检测，DAB显色，苏木精轻度复染。每张切片取5个视野（×400倍），测定每个视野的阳性细胞数，取其平均值。

1.3.2TUNEL染色以不加TdT酶作为阴性对照，细胞核染成棕褐色的为凋亡阳性细胞。每张切片取5个视野（×400倍），计数每个视野的阳性细胞数，取其平均值。

1.3.3图像分析采用Mias(2000型)图像分析系统对海马及海马皮层Bcl-2蛋白、TUNEL阳性细胞进行定量计数。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件进行处理。检测结果以均数±标准差(x±s)表示。多样本均数比较采用方差分析，两两比较采用t检验。

2结果

2.1行为学观察正常对照组未出现癫痫发作。实验组大鼠在给予匹罗卡品后15min～30 min均出现洗脸样动作、节律性咀嚼、点头等面部痉挛样动作；随后出现前肢阵挛，之后很快表现为前肢阵挛伴站立，进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒，反复发作，达到癫痫持续状态。实验组大鼠成功72只，成功率 92.3％，死亡2只，并随机补充。

2.2HE 染色结果正常对照组神经元排列整齐紧密，细胞呈圆形或椭圆形，胞浆透明且染色质分布均，核仁清晰；模型组出现了嗜酸性神经元，表现为细胞排列紊乱，胞体收缩明显，胞浆红染，胞核固缩；依达拉奉组也出现嗜酸性神经元，但数量较少，细胞排列松散；联合治疗组嗜酸性神经元极少，但细胞排列尚整齐，形态接近于正常。

2.3Bcl-2蛋白的表达情况细胞浆及核膜内出现黄色或棕黄色样物质为Bcl-2阳性细胞。每张切片取5×400倍视野，计数每个视野的阳性细胞数，取其平均值。C组有基础量的Bcl-2蛋白表达。与对照组相比，M组Bcl-2蛋白表达12 h达高峰，24 h开始减少，48 h继续减低，72 h到7 d减至基础水平（P

2.4TUNEL染色结果TUNEL染色阳性细胞即凋亡细胞，主要表达在神经元及神经胶质细胞，表现为胞核中出现棕色颗粒，固缩聚集在核膜周边，呈典型的指环状或新月状的凋亡特征。M组TUNEL染色阳性细胞表达水平在12 h开始上升，48 h达高峰，之后有下降趋势（P

1）为山西医科大学第二医院院青年基金资助（No.20090202）

3讨论

癫痫对神经系统的损害并非随放电的终止而停止,一次癫痫急性发作就足以引起脑部特定区域神经元的脱失［1,2］，且损伤程度与发作别相关［3］。癫痫时伴有非常活跃的自由基活动［4,5］。自由基在癫痫损伤机制可能通过以下几点： 自由基的神经毒性作用,在癫痫急性发作病理过程中，大脑内过量产生的自由基通过灭活谷氨酰胺合成酶来促进兴奋性神经递质谷氨酸的异常增加,促进癫痫发生、发展；自由基使细胞膜离子通透性增加,使Ca2+内流增加,导致进行性去极化,引起神经细胞异常放电；自由基参与了癫痫发病病理过程，通过增加膜脂质过氧化以及减少致痫灶GSH-PX水平,引起神经元变性； 自由基与神经细胞损伤密切相关，是造成细胞死亡的原因之一,通过保护自由基所造成的破坏就可以减少癫痫发作所致细胞死亡［6］。

依达拉奉预处理癫痫动物模型后观察到，可以减少癫痫发作后的神经元凋亡，机制可能通过上调IRE1(the inositol requiring enzyme 1) 的表达及维持其活性以缓解内质网压力；依达拉奉可以通过拮抗氧自由基并抑制谷氨酸释放,在癫痫发作中发挥保护作用［7］；可显著缓解红藻氨酸致痫大鼠谷胱甘肽降低和4-hydroxy-2-nonenal（HNE)升高，依达拉奉神经保护效果是通过抑制脂质过氧化实现的［8］，但是高剂量依达拉奉(20 mg/kg)延迟点燃发展，缩短后放电持续时间和提高后放电阈值。这些数据显示该剂量的依达拉奉通过阻止癫痫发挥抗癫痫效果［9］。

癫痫持续状态发生时候患者不大可能在发作前接受干预性治疗，所以如果在癫痫发作后给予依达拉奉可以阻止神经元的丢失将是一大优势。故本实验选用依达拉奉在癫痫发作后给药，观察其对海马神经元凋亡的影响。Bcl-2家族在癫痫细胞凋亡过程中作用主要是抑制细胞凋亡。Bcl-2蛋白位于线粒体膜或核膜及溶酶体膜的膜蛋白，可以通过多种途径有效抑制细胞凋亡的发生。

本实验中观察到，应用依达拉奉后大鼠海马局部Bcl-2蛋白表达增加，TUNEL染色阳性细胞减少。依达拉奉治疗组低于模型组，但高于联合治疗组；联合治疗组与空白对照组相比仍有差别。依达拉奉可以减少癫痫持续状态后的神经元凋亡，可能通过清除自由基起到一定的脑保护作用。在癫痫发作后及时给予自由基清除剂可减轻癫痫发作所造成的脑损伤，可以有效减少癫痫持续状态神经元细胞凋亡，为临床辅助治疗癫痫提供进一步的支持证据。与管得宁等［10］的临床研究结果相符，依达拉奉可显著改善患者预后。

参考文献：

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［10］管得宁，徐运，王钟.依达拉奉辅助治疗难治性癫痛的疗效及机制［Ｊ］.中风与神经疾病杂志，2007,24,(3):358-359.

作者简介：薛国芳（1976―），女，主治医师，现工作于山西医科大学第二医院（邮编：030001）；郑辑英（通讯作者）、李光来、李东芳、王改青、陈文军，工作于山西医科大学第二医院（邮编：030001）；牛海雁，工作于山西省长治市人民医院； 齐登斌，为山西医科大学2008级神经内科硕士研究生。

(收稿日期：2011-01-22)