产柠檬酸用黑曲霉的选育
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摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。
引言
柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。
柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。
1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。李文玲等也曾经用Co60～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。
2)黑曲霉(Aspergillus niger)的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生孢子。黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般pH值为3～7；产酸最适pH值为1.8～2.5。生长最适(optimum)温度为33～36℃，产酸最适温度在28～36℃，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在35°Be左右的麦芽汁培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。
1.主要工作内容和目标
用已有菌种进行分离复壮、种子斜面扩大培养、麸曲孢子培养和摇瓶培养，检测菌种的产酸能力，然后反复选择出产酸能力最大的菌种，最后用沙土管保存备用。目标是使经过第二次选育的菌种的产酸能力比第一次提高20％以上。
2.研究方案
3.药品和材料(见下表)
5.分析检测方法
酸度测定：碱式滴定法
波美度算法：144.3 144.3/p
p：麦芽糖的密度
残留淀粉检测：碘液滴定试验
6.菌种自然分离复壮方法
6.1 第一次自然分离复壮
配制察氏培养基。将平碟、1ml吸管、冷却水、装有99m1稀释用水的250ml三角瓶、装有20ml及小玻璃珠的100ml三角瓶、接种环、察氏培养基等物品在0.11MPa高压蒸汽灭菌30分钟。在酒精灯火焰旁将培养基倒入平碟，使成薄层，放平冷却；灼烧接种环，从出发菌种斜面上取一环孢子放入盛有玻璃珠的三角瓶内，摇震5～10分钟，使孢子呈分散状态；吸取孢子悬浮液1ml，依10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释，每吸一次换一根吸管；将10-5孢子悬浮液吸取0.5ml放入平碟中，合拢平碟，左右摇动，使孢子悬浮分布均匀，待冷却后放入恒温室(35℃)培养3天后取出置于冰箱内(4℃)保存(培养时平碟底部朝上，并注明时间与菌种编号)。
6.2 第二次自然分离复壮
方法采用划线分离法，好处在于它省去了稀释法的复杂步骤以及容易染菌的缺点，具体方法如图1所示。
7.菌种斜面孢子扩大培养方法
制备麦芽汁琼脂斜面。将干麦芽磨碎，用60目筛子过筛去麸皮。加入3.5倍麦芽粉重量的蒸馏水，然后在65℃的水浴锅中糖化3～4h。糖化快结束时取少量糖化液，加入碘液，看是否显蓝色，如果显蓝色则继续糖化，直至糖化液加入碘后不显蓝色。取出糖化液放置冷却，将其稀释至35°Be、pH 6.4，加入2％琼脂。将加入了琼脂的麦芽汁加热，再分装至四支试管，最后灭菌，接种。
8.麸曲孢子培养方法
将100ml三角瓶烘干，分装入已用水搅匀的麸皮(麸皮应无霉变结块，麸皮加水量是30g麸皮用水30～35mi)，塞紧棉塞，用牛皮纸包扎好。将接种针、冷却水、麸皮瓶等物品在0.11MPa的灭菌锅中灭菌70分钟(延长灭菌时间以使麸皮中的杂菌被完全杀灭)，灭菌后乘热将三角瓶内的麸皮摇动，放置冷却。将一支符合标准的斜面孢子接入麸皮三角瓶内(一瓶只接一环孢子)，接种完毕后塞紧棉塞用牛皮纸包扎好。将接种好的麸皮三角瓶放入恒温室(35±1℃)培养10天，每24h翻动一次，直至孢子着生密集、培养基松散为止，再静止培养10天取出。
9.摇瓶试验方法
9.1 考察对象
1)每支符合斜面孢子标准的成熟的斜面孢子；
2)每瓶符合麸皮孢子标准的成熟的麸曲孢子。
9.2 制备种子培养基和发酵培养基
1)选用50ml锥形瓶；
2)对接种针、冷却水及种子培养基和发酵培养基进行灭菌。
10.菌种保藏方法：沙土管保藏。
11.选择菌的方法和标准
11.1 察氏培养基上单菌落的选择标准
1)小菌落；
2)菌落凸起；
3)菌丝淡黄色；
4)孢子落生长稀疏，棕褐色并布满整个菌落；
5)无延伸菌丝。
11.2 斜面孢子的选择标准
1)斜面孢子着生密集；
2)孢子成溧褐色至黑色；
3)无杂菌。
11.3 麸皮孢子的选择标准
1)孢子着生密集，整个麸曲呈深褐色；
2)无杂菌；
3)无白毛。
12.实验结果
12.1 察氏培养基上单菌落的生长状况(见下表)
12.4 菌种斜面孢子扩大培养
结果：1、4、5号试管生长良好，2、3号试管染有放线菌。
12.5 麸曲孢子培养
结果：1、2、3号瓶均符合。
12.6 摇瓶试验
将1、4、5号试管中的斜面孢子接种到1、2、3号种子培养基发酵摇瓶；将1、2、3号锥形瓶中的麸曲孢子接种到4、5、6号种子培养基发酵，36h后取出测柠檬酸的产量、pH值，将1、2、3、4、5、6号摇瓶的菌丝体分别接种到1、2、3、4、5、6号发酵培养基摇瓶中，放入摇床上培养后取出测酸度、PH值。
12.7 产酸量测定
比较菌种选育前后，第一次实验二级发酵的最大产酸量是1.14624g/L，第二次实验二级发酵的最大产酸量是2.016g/L，第二次实验的产酸量相对于第一次来说提高了75.88％。育种之后产酸量明显提高。
13.注意事项
在麦芽汁培养基和麸曲孢子培养基上菌种的生长情况对菌的产酸能力有明显的影响，生长状况好的产酸率就高，否则就低，因此在实际生产中要特别注重在麦芽汁培养基和麸曲孢子培养基上的生长环节。在摇瓶发酵的过程中，我们要保持足够的通氧量，在温度控制方面，要控制温度在35±1℃，这样的温度下菌的生长速度快，在用恒温培养箱进行培养时我们最好是用温度计校正一下培养箱内的温度，因为有的时候设定的温度和实际的温度有差别，如不进行校正的话，将影响到菌的生长，严重的甚至会使育种失败。