食品中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

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[摘 要] 目的：建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的pcr方法。方法：优化金黄色葡萄球菌DNA提取方法并设计基因特异性引物，采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶（nuc）编码基因，验证检测的特异性及灵敏度。结论：所检出的金黄色葡萄球菌在497bp处出现特异片段，该方法具有较高的敏感性和特异性，可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段。

[关键词] 金黄色葡萄球菌 PCR DNA提取

[中图分类号] TS201.1 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2013）05-0057-01

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureu.SA）可分泌多种毒性蛋白质。其分泌的葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal eaterotoxi，SE），可引起金黄色葡萄球菌食物中毒[1]。因此，如何应用快速准确的检测方法，对于诊断金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及预防该菌引起食物中毒有重要意义[2-4]。现阶段对金黄色葡萄球菌的检测，以往主要依赖常规微生物学方法，一般需要5～7 天，既费时又费力，为此，本研究利PCR技术扩增SA基因来快速直接检测金黄色葡萄球菌，取得了很好的效果，现将试验结果报告如下。

一、材料与方法

1.材料

1.1 试验菌种

金黄色葡萄球菌标准菌株、大肠杆菌，李斯特菌、枯草芽孢杆菌，由本实验室保存。

1.2 主要试剂

蛋白酶K，购自上海Sangon公司，TaqDNA聚合酶，10×buffer，25mmol/L MgCl2，dNTP，DNA Marker，均购自华美生物工程公司。

1.3 引物合成

上游引物F：5’-CAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAAT-3’；下游引物R：5’-CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-3’。引物扩增核苷酸长度为494 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 仪器与设备

GL-16G 型高速台式离心机，（上海医用分析仪器厂），TGRADIENT 型 PCR 扩增仪，（BIOMETRA，德国），DYY-III 型电泳仪，（北京六一仪器厂），Jel Doc2001 型凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）。

1.5检测样品

从吉林市周边奶牛场随机采集生鲜奶样，共10 份。

2.方法

2.1黄色葡萄球菌基因组DNA 的提取[5，6] 取300μl菌悬液，离心，收集菌体，加入TE缓冲液467μl，20 mg/ml溶菌酶12μl，0℃ 1 h，并间隔摇晃几次，取出放置-20℃，20min，立即放入69℃水浴10 min，加入10%SDS 53μl，69℃水浴15 min，取出加入5 mol/L NaC1 87μl，CTAB/NaC1（1%CTAB，0.73mol/L NaC1）68-69℃水浴15min，-20℃置30min，取出加入等体积的氯仿/苯酚（200μl：200μl）混匀，离心取上清；重复上述步骤一次，加入等体积的氯仿/苯酚（200μl：200μl）混匀，离心取上清；最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20℃静置30min，离心去上清，沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥30min，沉淀溶于40μl TE中，于-20℃保存。

2.2 PCR 扩增 反应体积为40μl。其中10×PCR buffer 5μl， dNTP（ 浓度为2.5 mmol/L） 2.5μl， 引物F和引物R（ 浓度为5μmo1/L） 各2.5μl， 模板溶液1μl， 双蒸水16μl， 置98℃水浴10 min， 再冰浴5min， 加Taq 酶（3U/μl）0.5μl， 最后加10μl石蜡油覆盖。PCR 循环参数： 95℃预变性10 min； 94℃变性40s， 54℃退火45s， 72℃延伸90s，循环30次，4℃保存。

二、结果

1.PCR扩增引物基因的特异性

金黄色葡萄球菌为阳性菌，扩增出长为497bp的DN段，然而李斯特菌、枯草芽孢杆菌、等都未扩增出片段，结果为阴性。

2.PCR扩增nuc基因的敏感性

将食品中金黄色葡萄球菌DNA样品（105ng/μl进行10倍梯度稀释为10.5ng/μl、1.05ng/μl、105pg/μl、10.5pg/μl、1.05pg/μl、分别取1μl上述样品进行PCR扩增，该体系在样本稀释至10.5pg/μl时候，仍可以扩增出特异条带，表明该方法具有较高的灵敏度。

三、讨论

综上所述， 本研究所建立的PCR方法检测金黄色葡萄球菌具有特异性强、敏感性高、检测成本低、检验周期短、操作简便等优点。对多种食品样品检测的结果表明， 该法对检测食品中金黄色葡萄球菌的污染具有较好的应用价值， 为检测食品中的金黄色葡萄球感染的临床诊断和流行病学调查提供了较好的手段， 在应对细菌性食物中毒突发公共卫生事件中具有重要的意义。

参考文献

[1]黄岭芳 赖卫华 张莉莉（南京大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌330044）2009年6月第25卷第6期（食品中金黄色葡萄球菌快速检测方法的研究进展）.

[2] 黄佩瑁，石超，潘世扬，等.金黄色葡萄球菌DNA提取方法的改良[J].临床检验杂志，2002，20（2）：106.

[3] [美]J.萨姆布鲁克，D.w.拉塞尔，著.黄培堂，译.分子克隆 实验指南[M].第3版.北京：科学出版社，2002.

[4] 唐俊妮.金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因的功能与特征分析.华中农业大学，2007.

[5]王晓梅，马莉，陈颖，等1感染性腹泻病原菌分布分析[J]1医学论坛杂志， 2006， 27（13）：43- 451 .

[6]Jun Ni Tang ，Fei Long ，Xian Ming Shi ，Chinese Journal of Health Laboratory Technology，Aug 2008；Vol 18 No 8.

[7] 陈靖，陈叶.用酶联免疫吸附法（ELISA）检测金黄色葡萄球菌肠毒素[J].中国食用菌，1999，18（5）：39-40.