分子标记技术及其在油茶遗传育种中的应用
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摘要：分子标记技术为植物遗传育种研究提供了新途径，综述了部分分子标记技术的原理及其在油茶遗传育种研究中的应用现状。
关键词：分子标记；油茶；应用
中图分类号：S515 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）03-0053-03
油茶（Camellia oleifera）别名茶子树、茶油树、白花茶，其油茶子油是我国南方地区人民喜爱的食用油，不饱和脂肪酸为油茶子油中较稳定的油酸，不稳定的多不饱和脂肪酸含量较少，且油中富含生育酚、角鲨烯等天然抗氧化剂，因此油茶子油温度性好，不易氧化酸败，是一种优质食用油[1]。曾经油茶作为一种经济林树种得到了广泛的栽培，但却忽略了品种的优选工作，导致在长时间内多数油茶挂果率低、油品不高、经济效益低下。现如今由于人们追求天然、安全、保健的饮食新时尚，茶油在粮油市场中凸显出重要的价值，这就需要选育出优良高产的油茶品种，以适应市场的需求。
在植物遗传育种研究中，使用较多的方法是传统育种，但传统育种方法通常周期长，带有一定的盲目性。现在提倡分子标记辅助育种与传统育种相结合，分子标记辅助育种是利用分子标记技术，借助于目标基因紧密连锁的遗传标记的基因型分析鉴定含有目标基因的个体，从而提高选择效率，减少盲目性，加速育种进程，在一定程度上弥补了传统育种缺陷。与形态学和同工酶标记相比，分子标记技术具有明显的优越性，分子标记技术已是植物遗传改良研究中强有力的工具。它不受个体发育时期和环境条件的影响，直接反映了DNA水平上的遗传变异情况，可以稳定遗传。大多数分子标记呈共显性遗传，有利于隐性性状的选择，而且基因组变异丰富，分子标记的数目几乎是无限的。
现今，已有多种分子标记技术应用于油茶遗传多样性、品种鉴定等方面的研究。本文就已使用的分子标记的原理和在育种上的应用情况进行综述，以期对油茶资源的利用和开发提供有益的参考。
1 分子标记技术简介
1.1 AFLP技术
扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术由荷兰科学家Zabeau与Vos等[2]创建的，是RFLP技术和PCR技术的结合，具有前者的可靠性和后者的高效性。
AFLP技术先用两种限制性内切酶切割基因组DNA，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。然后将双链接头连接到DN段的末端，形成一个带接头序列的特异片段，作为引物结合位点。通过接头序列和PCR引物3′末端的选择性碱基的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段。由于引物的合成具有特异性，从而使扩增产物也具有特异性[3，4]。
1.2 RAPD技术
随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA， RAPD）技术是1990年美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh领导的2个小组几乎在同时发展起来的[5，6]。它是以一种或多种人工合成的、长约9～10个寡核苷酸的随机引物对靶基因组DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离和对DN段染色，由于引物对不同物种的基因组DNA扩增区域片段长度的差异产生多态性[7，8]。1.3 ISSR技术
简单重复间序列标记（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利尔大学Zietkiewicz等于1994年创建的一种分子标记技术[9]，利用SSR在基因组DNA中广泛存在的特性，在3′或5′端锚定2～4个碱基做引物，对两端具有反向排列SSR间的一段序列进行PCR扩增。ISSR分子标记不仅具备SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，并且与SSR相比其多态性更为丰富[10，11]。
1.4 SRAP技术
相关序列扩增多态（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）标记是由美国加州大学作物系Li于2001年在研究芸薹作物时开发出来的一种标记技术[12]，SRAP主要对植物基因组中开放阅读框区域进行扩增，利用外显子富含GC而启动子、内含子富含AT的特点设计引物。其上游引物主要结合在外显子区域，对外显子进行特异扩增，下游引物的结合位点在内含子区域或启动子区域，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。由于在物种间或同一物种的不同个体间内含子、启动子与间隔序列长度是不等的，从而造成多态性的产生[13]。
2 分子标记技术在油茶遗传育种中的应用
2.1 遗传多样性研究
遗传多样性在一定程度上能反应植物对环境的适应能力，其研究结果为植物种质资源保护、品种改良和开发利用提供理论基础。油茶属异花授粉植物，由于长期的自然选择和人工选择，可能其种内变异比较丰富，遗传背景也比较复杂。杨扬等[14]利用9对多态性较为理想的SRAP标记对6个小果油茶群体的180份材料进行遗传多样性研究，共扩增出184条带，全部为多态性条带，多态性位点比率高达100%，有效等位基因数（Ne）为1.776 3，Nei基因多样性指数（H）为0.432 8，平均Shannon（I）信息指数为0.623 3，说明小果油茶群体具有较为丰富的遗传多样性，但其遗传变异主要分布在群体内，群体间变异相对较小。基于研究结果，提出了一些对该物种遗传多样性的保护策略。张婷等[15]采用AFLP标记对来自湖北省5个地区的油茶遗传多样性进行研究。在4对引物对48个个体扩增中，共获得清晰的扩增条带45条，其中多态性条带38条，多态性位点比例为84.44%，油茶居群的多态位点在22.22%～53.33%，有效等位基因数（Ne）在1.140 1～1.228 3，Nei基因多样性指数在0.084 3～0.144 2，Shannon 信息指数在0.126 2～0.227 8。说明油茶不同居群间遗传多样性水平相差较大，油茶遗传分化主要存在于居群内。范小宁等[16]为了深入掌握油茶杂交子代的遗传多样性程度，为油茶杂交育种选育提供指导和理论支撑。用9对条带丰富、多态性高、重复性好的引物组合，采用优化的SRAP-PCR反应体系对4个控制授粉家系的子代合计共52个个体进行PCR扩增，结果共检测到191个位点，平均每对引物21.2个，扩增片段长度在100～700 bp，其中多态性位点191个，多态位点百分比高达100%，Nei基因多样性指数（H）为0.333 7～0.366 4，Shannon信息指数（I）为0.503 8～0.545 0。结果表明遗传多样性主要存在于家系内，而家系间的遗传多样性较小，仅只占总遗传变异的4.78%。4个控制授粉家系内各个子代个体间都存在着丰富的遗传多样性。结果提示在通过杂交育种技术培育油茶新品种工作中，应以杂交后代个体选择为主，而优良家系选择对油茶产量提升的潜力较小。
2.2 品种鉴定
在传统育种工作的基础上，大部分植物都培育了很多品种，一些品种具有较为相似的形态，并且也存在同物不同名的现象。目前在油茶良种的鉴别中主要还是使用形态标记，包括叶片、枝条或者种子的形态，当这些形态学标记一旦脱离油茶植株个体后，良种无性系或种源在形态上高度相似，时常出现假冒良种的情况，对油茶产业造成较大的损失，严重地影响了我国油茶良种化的进程，不利于油茶产业迅速发展。鉴于此，为了有效地区分油茶品种就必须建立合适的分子鉴别机制。韩欣等[17]以14个赣南油茶良种为研究对象，提取叶片基因组DNA作为扩增模板，筛选出稳定性高的引物组合，采用优化的SRAP-PCR反应体系，对获得的清晰且重复性强的条带进行{0，1}数据转换，并根据SRAP谱带特征建立了赣南油茶良种的分子鉴别体系，为油茶良种的分子鉴定提供了理论依据和技术基础。油茶良种鉴别是解决目前生产上种苗混乱的重要途径，林萍等[18]采用SRAP方法，对油茶长林系列12个优良无性系进行分析。利用筛选出的15对多态性高引物，共扩增得到423个位点，多态性位点比例为93.14%，品种特异性位点达50个，其中有13对引物能够独立鉴别所有供试材料。为了提高鉴别效率，选择24个多态性高的位点进行组合，建立了所有供试材料的DNA指纹图谱，实现了供试材料的有效鉴别。
2.3 亲缘关系分析
亲缘关系是育种时杂交亲本选择的基础，弄清不同品系间的遗传相似性，减少杂交亲本选择的盲目性。彭方仁等[19]利用ISSR和SRAP两种分子标记对192 份油茶种质材料进行分析，其中有171份来自湖南长沙的浏阳油茶丰产栽培示范基地（湖南省油茶良种示范基地的烟坡、北坡、马家塘和温室大棚），另外21份采自南京林业大学树木园（该样品材料为移栽的1年生油茶嫁接苗）。结果表明油茶种质资源的遗传相似系数范围分别为0.52～1.00和0.65～0.95，说明这些油茶种质材料间的遗传相似度较高，亲缘关系比较接近，也说明了所收集的油茶种质材料的遗传基础比较狭窄。于小玉等[20]以湖南、湖北两省主要油茶品种为试验材料，利用ISSR 分子标记技术对66个油茶品种的亲缘关系进行了探讨。这66个油茶品种在相似系数0.61水平处分为3大类，从聚类分析结果看，部分地理来源相同或遗传背景相似的品种资源能够聚在同一类群，但也有一些地理来源及遗传背景不一致的品种资源也聚集在同一类群，显示的亲缘关系较为复杂，导致聚类结果的不规律。分析其原因可能是油茶已有悠久的栽培历史，在长期的栽培历史中，各油茶产区遗传资源不断交流所致，也有可能是研究的品种数量不均匀所致。
油茶与油棕、橄榄和椰子并称为世界四大木本油料树种，在我国已有2 000多年的利用和栽培历史，但其发展状态一直起伏不定。自20世纪70年代开展油茶优树选育以来，全国已选出了200多个油茶优良无性系、优良家系等良种，在生产中应用已显示出了巨大的增产潜力，但距离实现油茶生产良种化还很远[21]。这就需要加快良种的选育进度，加快分子标记辅助育种与传统育种的结合。虽然应用分子标记技术对油茶的研究已取得一定的成绩，但与其它植物或农作物相比，油茶的分子标记研究远远落后，在遗传图谱构建、基因定位等方面尚无报道。在今后，要利用分子标记技术，积极开展油茶基因组学研究，培育并筛选出更高产量、高含油量、高抗逆性的油茶新品种。
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