头孢哌酮钠中乙二胺四乙酸二钠的检查

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[摘要] 目的 运用高效液相色谱法测定头孢哌酮钠原料药中乙二胺四乙酸二钠的含量。 方法 采用依利特ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以pH 3.4醋酸盐缓冲液及乙腈为流动相，进行梯度洗脱；流速1.5 mL/min；检测波长254 nm；柱温40℃。 结果 EDTA-2Na的浓度与峰面积在25.23～75.68 μg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=6.5401X +5.4383，r=0.9999；平均回收率97.7%，RSD为1.0%。 结论 该方法可行，对头孢哌酮钠的质量控制有一定的意义。

[关键词] 高效液相色谱法；梯度洗脱；头孢哌酮钠；乙二胺四乙酸二钠

[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）10-102-02

头孢哌酮钠是日本富山化学工业公司研制开发的第三代头孢菌素，1981年上市，在国外通过辉瑞公司销售。头孢哌酮钠是我国国家基本药物，与其他第三代头孢菌素相比具有抗菌谱广、抗菌作用强、毒性低、疗效好、过敏反应少等优点，所以从上市以来，在临床上得到广泛的应用。我公司在生产头孢哌酮钠过程中，用乙二胺四乙酸二钠作为络合剂，查阅相关文献得知，但EDTA-2Na易与钙螯合，长期大剂量使用或静脉注射速度过快，乙二胺四乙酸二钠会与血液及骨骼中的钙形成水溶液螯合物引起低血钙症或骨钙流失，为确保其临床用药安全性，我们对产品中残留的二乙胺四乙酸二钠进行定量研究[1-2]。本实验参照文献[3-9]采用高效液相梯度洗脱法测定其中乙二胺四乙酸二钠的含量，操作简便、快速、结果准确可靠，并不受其他成分的干扰，可用于本产品中乙二胺四乙酸二钠的含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

美国安捷伦1200型高效液相色谱仪，Chemistation 色谱工作站；BP211D型万分之一电子分析天平，德国赛多利斯，科学仪器（北京）有限公司。头孢哌酮钠样品（由珠海保税区丽珠合成制药有限公司提供，批号为1004001、1004002、1004003）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，天津市福晨化学试剂厂提供）；水为注射用水；无水醋酸钠（分析纯，天津市广成化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，广州化学试剂厂）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为依利特ODS C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱温为40℃；流动相A为pH 3.4醋酸盐缓冲液（取醋酸钠0.68 g，冰醋酸5.8 g， 加水稀释成1000 mL，用冰醋酸调节pH值至3.4），流动相B为乙腈；流速为1.5 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为20 μL。按表1进行线性梯度洗脱。在此条件下，乙二胺四乙酸二钠色谱峰与相邻成分均可达到基线分离，见图1。

1.2.2 溶液制备 （1） 对照品溶液的配制：精密称取EDTA对照品50.00 mg，置于100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液5 mL，置50 mL容量瓶中，先加5 mL的1%硫酸铜溶液，再用水稀释至刻度，摇匀。（2）供试品溶液的制备：精密称取头孢哌酮钠样品50.00 mg，置50 mL容量瓶中，先加5 mL的1%硫酸铜溶液使溶解，再用水稀释至刻度，摇匀。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系的考察 取EDTA-2Na对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1毫升中含100 μg的溶液，作为线性母液。分别取线性母液5.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、15.0 mL置20 mL容量瓶中；加水稀释至刻度，摇匀，即得线性Ⅰ～Ⅴ溶液。按“1.2.1项”色谱条件精密进样20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以EDTA浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：Y =6.5401X + 5.4383，r=0.9999，结果表明，EDTA-2Na在25.23 μg/mL～ 75.68 μg/mL范围内浓度与峰面积线性关系良好。

2.1.2 精密度试验 精密吸取EDTA-2Na对照品溶液，按“1.2.1项”色谱条件进样，重复进样5次，记录所测量色谱的峰面积，得出EDTA峰面积的相对标准偏差RSD值为1.30%，实验结果表明，使用高效液相色谱法对乳酸钠的含量进行检测具有良好的精密度。

2.1.3 稳定性试验 取对照品溶液在5℃条件下放置，分别于0、2、4、6、8 h进样，以EDTA峰面积计算，RSD值为1.3%，表明对照品溶液在8 h内稳定。

2.1.4 加样回收率试验 精密称取EDTA对照品50.50 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密称取已知EDTA-2Na残留含量的本品（批号1004001，EDTA-2Na残留未检出）50.01 mg、50.17 mg、50.28 mg，置50 mL容量瓶中，分别加入上述对照品贮备液4 mL、5 mL、6 mL，再分别加5 mL的1%硫酸铜溶液，最后用水定容至刻度；分别制成高、中、低3个浓度的供试品溶液，按“1.2.1项”色谱条件进样，每个浓度下测试3次，计算EDTA的平均回收率（n=9）为97.7%，RSD=1.0%， 见表2。

2.1.5 检测限和定量限 取EDTA对照品溶液，逐步稀释，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按S/N=3（噪音高度的3倍）计算检测限；按S/N=10（噪音高度的10倍）计算定量限。结果EDTA的检测限为0.0238 ?g/mL；定量限0.0595 ?g/mL。

2.2 样品测定

取不同批次的头孢哌酮钠样品共3批， 按“1.2.2项”方法制备供试品溶液，按“1.2.1项”色谱条件进样， 测定EDTA-2Na的含量，见表3。

3 讨论

乙二胺四乙酸二钠含量测定多采用薄层分析、滴定法和比色法，由于这些方法专属性差、选择性差，故考虑采用专属性较高的HPLC法。在本实验中，我们通过较全面的方法学验证，建立了一种梯度反相HPLC测定法，在该色谱系统中，色谱峰保留时间适宜，峰形良好，重现性好，该方法用于测定头孢哌酮钠原料药中乙二胺四乙酸二钠的含量，准确、可靠。

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（收稿日期：2013-04-18）