小麦条锈病不同抗性材料中分子标记Yr24-2的检测

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摘要：为了研究小麦条锈病的抗性遗传基础及分子标记辅助持久抗性新品系选育技术，利用２２个条锈病抗性材料及４个感病材料并以近缘野生材料作为对照，进行抗性基因Ｙｒ２４分子标记的检测。结果表明，只有３个抗病材料（３、６、１２）扩增出目标带（１６５ ｂｐ），但扩增条带都较弱；４个感病材料（２３～２６）里没有目标条带出现；野生材料中的扩增结果表明该抗性基因及其分子标记来源于硬粒小麦。

关键词：条锈病；分子标记；Ｙｒ２４

中图分类号：Ｓ４３５．１２１．４＋２；Ｑ９４３．２文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）12－2553-03

Detection of Molecular Marker yr24-2 in Stripe Rust Resistance Wheat Cultivars

ＺＨＯＵ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ，ＷＥＩ Ｑｉ－ｃｈａｏ

（Ｋｅｙ Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ Ｏｐｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｎ Ｃｒｏｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｉｎ Ｈｅｎａｎ／Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，

Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｉｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ， ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ Ｙｒ２４ ｗas ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ２２ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ cultivars， ４ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ cultivars， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄ（１６５ｂｐ） ｗａｓ ｏｎｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ （３，６，１２）； ｂｕｔ ｔｈｅ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｗｅａｋ． Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ４ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈａｒｄ ｗｈｅａｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｔｒｉｐ ｒｕｓｔ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ； Ｙｒ２４

小麦条锈病是小麦锈病的一种，是我国小麦生产上分布广、传播快、危害面积很大的重要病害，流行年份给小麦生产造成严重危害甚至毁灭性打击［１］。小麦条锈病的大流行往往是由于新生理小种的出现，导致小麦品种抗性丧失。通过聚合育种将不同抗源的抗性基因聚合至一个个体培育出抗性更持久的新品种是长久防治小麦条锈病的根本措施。应用分子标记技术对抗病基因进行跟踪，实施分子标记辅助选择，可以快速有效地进行抗源累加，把多个抗病基因聚合在同一个品种中，从而大大提高育种效率［２］。研究通过对小麦条锈病的抗性基因分子标记Ｙｒ２４－２的筛选来考察一批抗性材料的抗性基因组成，为新品系的抗性遗传基础鉴定及持久抗性新品种选育提供理论及技术支撑。

１材料与方法

１．１材料

本研究所用的植物材料见表１、２。

１．２方法

小麦基因组ＤＮＡ的提取方法为ＣＴＡＢ抽提法［３］。

用前人已经报道的抗条锈病基因Ｙｒ２４的分子标记对上述２６个抗病、感病材料进行ＰＣＲ扩增［４，５］，来进行本研究（表３）。采用１５．０ μＬ反应体系：模板ＤＮＡ ３．０ μＬ，上下游引物各０．５ μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ １．５ μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１．４ μＬ，Ｔａｑ酶（２．５ Ｕ／μＬ） ０．４ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ７．７ μＬ。ＰＣＲ循环参数：９４ ℃、５ ｍｉｎ；９４ ℃、１ ｍｉｎ，５３ ℃、１ ｍｉｎ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃、１０ ｍｉｎ；４ ℃，保存。采用２％琼脂糖凝胶进行电泳，缓冲液为１×ＴＡＥ；电泳结果用凝胶成像系统进行拍照，保存。

２结果分析

２．１Ｙｒ２４－２在２６个材料中的扩增结果

试验结果表明（图１、图２），扩增出目标条带（１６５ｂｐ）的材料只有３号（ＢＮ５）、６号（０２Ｇ１３）和１２号（陕２５３－３），且这３个材料均为抗病材料，在２３～２６这４个感病材料里没有目标条带出现。

３个抗病材料扩增出来的目标条带都较弱，只有１２号（陕２５３－３）能够看出相对清晰的目标条带，说明这几个材料的基因组ＤＮＡ中与该标记引物序列配对区之间可能存在序列变异，导致引物结合力不够，扩增条带较弱；除１１号（抗白３号）、１４号（内２８３６）、１５号（ＴＭＡ３５）材料外还有大量非特异性扩增条带，分别在５００～６００ ｂｐ和２００ ｂｐ，说明该分子标记引物序列可能位于一个基因家族上，导致扩增出许多非特异的非目标条带，或者是由于ＤＮＡ本身的多态性所致；另外，扩增结果显示，除１５号（ＴＭＡ３５）、１６号（内乡１８８）材料外，其他材料都没有出现引物二聚体，说明该引物上下游序列间或引物自身没有或有极短互补配对区，引物质量较好。

２．２Ｙｒ２４－２在野生近缘材料中的扩增结果

Ｙｒ２４基因来源于硬粒小麦，为了进一步验证该基因分子标记Ｙｒ２４－２的正确性，以包含硬粒小麦在内的１２种野生近缘材料基因组ＤＮＡ为模板，进行了ＰＣＲ扩增。由图３可以看出，Ｊ１（四倍体硬粒）、Ｊ２（意大利硬粒）、Ｊ４（硬粒小麦）、Ｊ６（野牛）、Ｊ９（斯卑尔托）、Ｊ１２（波斯小麦ＰＳＳ）中均出现了１６５ ｂｐ左右的目标条带。从扩增结果来看，几种硬粒小麦（Ｊ１、Ｊ２、Ｊ４）都能扩增出目标条带，说明该抗性基因及其分子标记来源正确。该标记在Ｊ６、Ｊ９、Ｊ１２也能扩增出目标条带，暗示了这３种近缘材料中可能也含有Ｙｒ２４基因，至少含有与该标记引物序列配对区相似的ＤＮＡ序列，这为在野生近缘材料中寻找新抗源提供了分子学证据。

３讨论

条锈病抗性基因Ｙｒ２４对目前我国多数生理小种均表现高抗，说明含有Ｙｒ２４基因的品种在我国仍是有效抗源。因此，众多农业科技工作者对该基因进行了深入研究，开发了其分子标记［６－８］。为了探索该标记的直接应用效果，进行了该研究。研究结果表明，条锈病抗性基因标记Ｙｒ２４－２在２２个抗性材料中，只有３、６、１２号扩增出目标条带，这暗示其余的抗病材料中含有其他抗性基因；在４种感病材料中没有目标条带被扩增出来，在该抗性基因的来源材料――硬粒小麦中能扩增出目标条带，说明该抗性标记的特异性还是比较高的，但是扩增条带较弱，应进一步优化扩增条件，增加扩增条带特异性，降低非特异性扩增带，或者将扩增带回收，连接至载体，再进行转化测序，根据所得序列设计新的较长的特异引物，来增加扩增的特异性，方能作为条锈病抗性基因标记应用于分子标记辅助育种的研究［９，１０］。另外，研究中我们看到在另外３种野生材料中同样检测到与目标条带一致的条带，当然，我们无法肯定这些条带就真的是抗性基因标记，也许这些材料中只是含有相似的ＤＮＡ序列，但这为育种者在野生近缘材料中寻找新抗源基因提供了理论参考，也为抗性持久型新品种培育打下了基础。

参考文献：

［１］ 张金霞，钮力亚． 小麦条锈病研究进展［Ｊ］．天津农业科学，２００８， １４（４）：４９－５２．

［２］ 杨涛，关天舒，潘荣光，等． ＤＮＡ分子标记技术在作物单基因抗逆性育种中的应用［Ｊ］． 辽宁农业科学，２００３（３）：１８－２．

［３］ 黄萱，高丽美，张永彦，等． 一种优化的植物总ＤＮＡ提取方

法［Ｊ］． 西北植物学报，２００４，２４（６）：１１０３－１１０６．

［４］ 刘亚萍． 小麦抗条锈病近等基因系的抗条锈性分析及Ｙｒ２４的ＳＳＲ标记［D］． 咸阳：西北农林科技大学，２００５．

［５］ 刘亚萍． 小麦抗条锈病基因Ｙｒ２４的ＳＳＲ标记［Ｊ］． 植物病理学报，２００５，３５（５）：４７８－４８０．

［６］ ＭＣＩＮＴＯＳＨ Ｒ Ａ，ＬＡＧＵＤＡＨ Ｅ Ｓ． Ｇｅｎｅ Ｙｒ２４ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄ，２０００，１１９（1）：８１－８３．

［７］ ＡＬＩ Ｍ，ＪＩ Ｗ Ｑ，ＨＵ Ｙ Ｇ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ f．sp． ｔｒｉｔｉｃｉ） ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ ｌｉｎｅ Ｎ９５１７５［Ｊ］． Ｐａｋ Ｊ Ｂｏｔ， ２０１０， ４２（１）：３８３－３９０．

［８］ ＡＬＬＡＮ Ｒ Ｅ，ＰＵＲＤＹ Ｌ Ｈ． Ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ，１９６７，５１：１０４１－１０４３．

［９］ 李根桥． 川麦４２抗条锈病基因ＹｒＣＨ４２的定位及其与Ｙｒ２４和Ｙｒ２６的等位性检测［Ｄ］． 乌鲁木齐：新疆农业大学，２００６．

［１０］ 董淑静，许为钢． 小麦条锈病抗性基因研究进展及分子标记辅助聚合育种［Ｊ］． 中国农学通报，２００９，２５（１３）：１９０－１９６．

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