大鼠上颌第一磨牙正畸移动中牙周膜神经PGP9.5的表达

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[摘要]目的:建立大鼠正畸牙移动模型,观察PGP9.5在牙周膜(PDL)神经中的表达及变化,探讨正畸力转化成神经元的反应的细胞调控机制。方法:成年雄性SD大鼠25只,随机分为5组:加力0、3、7、14、21天组,每组5只。上颌第一磨牙(URM1)施加50g近中向的拉力,按实验期限,分别取不同组大鼠含磨牙及其周围牙槽骨的组织块切片,进行PGP9.5免疫组化染色。镜下观察牙齿压力侧牙周膜神经纤维PGP9.5免疫阳性的变化情况,并进行灰度值分析、统计学方差分析和t检验。结果:压力侧的神经纤维的密度增加。在第7天牙槽骨表面出现类骨质的沉积;第21天根吸收陷窝处可见免疫阳性的牙周神经纤维。第3、7天牙周膜神经纤维PGP9.5的表达最强(P

[关键词]牙周膜神经;PGP9.5蛋白;正畸力;灰度值

[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)04-0555-04

The expression of PGP9.5 in the periodontal tissue during experimental orthodontic tooth movement in rats

CHEN Jiang-shan,ZOU Min

(Department of Orthodontic,Stomatology Hospital of Xi`an Jiaotong University,Xi'an 710004,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression and change of PDL nerve cell mechanoreceptor,and its cell division control during the transform from orthodontic force to the reaction of nerve cells by PGP9.5 immunohistochemistry staining following the establishment of animal model.Methods25male SD rats were divided into 5 groups randomly, each group had 5 rats. Putting a mesial tensile force of about 50g on URM1,the rats were forced at 0d,3d,7d,14d,21d.Tissue blot containing the molar and its surrounding alveolar bone were obtained;PGP9.5 immunohistochemistry staining was applied to measure after fixing.The change of the PDL nerve fiber PGP9.5 expression on the pressure side were observed and analyzed by gray value analysis and Statistical analysis of variance and the t test.ResultsThe density and expression of PGP 9.5 immunoreactive nerves on the pressure side increased and achieved max especially at 3d、7d(P

Key words:PDL nerve;PGP9.5;orthodontic force;gray scale

近年来,有关神经系统参与正畸牙移动的研究越来越受到学者们的关注。以往的研究主要是探讨实验性牙移动时神经递质在牙周组织改建中的作用,但有关正畸力在神经元中表达的信号传导机制并不是很明确。本研究采用免疫组化的方法,观察在实验性正畸牙移动过程中牙周膜神经末梢神经元内蛋白基因产物9.5(protein gene product9.5,pgp9.5)的表达情况,为进一步从分子水平探索正畸力转化成神经元的反应的细胞调控机制提供理论依据。

1材料和方法

1.1主要试剂及仪器:PGP9.5抗体(Chemicon生物公司);SP-9001免疫组化染色试剂盒、DAB显色盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);4%多聚甲醛固定液、10%EDTA慢脱钙液、505E冰冻切片机(MICROM公司,德国)、Q550CW图像信号采集与处理仪(莱卡公司,德国)、细金刚砂车针、正畸用弹力线、正畸测力计、0.25mm正畸不绣钢结扎丝、自制手术台、开口器、拉钩。

1.2动物模型的建立及分组:成年健康雄性SD大鼠25只(西安交通大学动物中心提供),体重(180±20)g,随机分为5组:加力0(对照)、3、7、14、21天,每组5只。

本实验采用大鼠上颌右侧第一磨牙(URM1)为实验牙。300mg/kg的计量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。麻醉后仰卧固定,用牙科高速涡轮机细金刚砂车针在上颌两个切牙唇侧及远中和UM1近中轴角处,磨出深约0.5～1mm的固位沟。用0.25mm直径不锈钢正畸结扎丝将弹力线结扎在上颌切牙和UM1间,产生牵引UM1向近中移动约0.49N(50g)的拉力(如图1)。严密监控大鼠的矫治器,若有损坏和脱落,及时安装。

1.3标本的制备:分别在各组时间点将大鼠处死,取出上颌骨。置10% EDTA液中4℃下脱钙4周。将脱钙后的上颌骨去除多余组织,保留磨牙,入30%蔗糖24h,4℃至组织沉底。沿近远中方向纵行切片,片厚20μm,-80℃冷冻保存。

1.4免疫组织化学染色:常规SABC染色方法,切片干燥30min后,0.01mol/L PBS(PH值7.4)冲洗3次后,经0.3%双氧水封闭内源性过氧化物酶,正常羊血清封闭非特异性染色,滴加PGP9.5多克隆抗体,工作浓度1:2 000,37℃下孵育过夜,此后依次滴加生物素酶标记羊抗兔IgG第二抗体及链酶亲和素-过氧化物酶复合物(SABC)各30min,DAB液显色。脱水,透明,封片,光镜观察,PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5图像分析:本实验采用光密度分析,显色底物为DAB,染色呈棕黄色,颜色深浅反映了DAB的沉积量,即目标抗原的量。光密度即为图像的灰度,与染色程度成反比,即蛋白表达强则标本染色强,透光弱,灰度值低;反之,则标本染色弱,透光强,灰度值高。每组SABC染色切片各一张,使用Q550CW图像信号采集与处理仪,对每张免疫组化染色后的切片作PGP9.5分析。测量得出平均灰度值。染色强的标本透过弱,灰度值低,阳性率高;染色弱的标本透光强,灰度值高,阳性率低。

1.6统计学分析

1.6.1质量控制:为了减小测量误差,选择2名实验观察者,其学历、资历、技能相近,掌握图形分析软件的基本操作,事先未参与实验设计。在3个月内对受检标本进行3次测量,所有数据进行t检验,无统计学差异。此时选用平均值纳入统计。

1.6.2数据采用数据±标准差表示,利用Spss13.0统计分析软件对实验数据进行统计学分析。对数据进行正态性检验及方差齐性检验,方差齐时,组间两两比较采用t检验;方差不齐时,两两比较采用t'检验,P

2结果

2.1组织学观察

2.1.1对照组(0天):根尖和根中1/3牙周膜内可见PGP9.5免疫阳性的神经纤维,其中一部分与牙骨质平行。在牙周膜的根尖区域,PGP9.5免疫阳性的神经纤维主要分布在血管周围。少许牙周神经纤维延伸到牙根的表面和细胞牙骨质层(如图2)。

2.1.2实验组:①3天组(如图3):与对照组相比,压力侧的神经纤维的密度增加。其中根尖压力侧近牙槽骨区可见稠密的、串珠状的神经纤维的神经纤维无规则的排列;②7天组(如图4):与对照组相比,压力侧的神经纤维的密度有所增加,近牙槽骨区可见沿着血管分布PGP9.5免疫阳性的神经纤维。而靠近牙骨质区,没有看到分枝状的神经末梢。在牙槽骨表面出现类骨质的沉积。但是在牙根吸收区或附近,并没有发现神经纤维;③14天组(如图5):神经密度减小,接近对照水平。根尖牙周膜的神经主要集中在靠近牙槽骨的区域。在一些区域还是可以看到透明化的牙周组织残留,但是牙周膜神经纤维在这些透明区的附近很少发现。在牙根吸收区域内或附近,没有出现牙周膜神经纤维;④21天组(如图6):大鼠上颌右侧第一磨牙的根吸收陷窝处可见免疫阳性的牙周神经纤维;这些神经纤维靠近细胞牙骨质层。在修复牙本质形成的区域,有免疫阳性神经局限性的萌发反应。透明化的区域已经几乎全部消失。

2.2灰度测定:正畸加力实验组和对照组的压力侧牙周膜PGP9.5免疫阳性的神经纤维的平均灰度值见表1。牙周膜中不同区域的神经纤维分布不相同,因为本实验把牙周膜三等分:根颈1/3,根中1/3,根尖1/3。

统计分析结果如下:①正畸加力3天组,其根尖1/3和根中1/3区域的压力侧牙周膜PGP9.5免疫阳性的神经纤维的灰度值较对照组低,具有极显著性差异P

3讨论

大鼠属啮齿类动物,磨牙均为多根牙,结构与特性均类似于人的牙齿,大鼠上颌磨牙有远中方向的生理移动,以切牙的支抗拉上颌第一磨牙近中移动时需要较大的力。以往研究认为40～60g的持续力移动效果较好[1],所以本研究选用50g的牵引力,但有根吸收出现,可能最恰当的力需进一步研究确定。

正畸力可引起牙槽骨的生理性吸收和增生,这两个过程的发生导致正畸牙的移动。目前已经被测出介导这种过程的生化信号包括前列腺素、神经递质、细胞因子、白介素系列等。牙周膜中含有丰富的神经末梢,在矫治力的作用下,该神经末梢变形,向中枢或外周释放各种神经递质;神经递质作用于牙周膜中相应的靶细胞,使该细胞内的第二信使水平增加,发生新细胞的生成和增殖,导致牙周膜、牙槽骨等牙周组织的改建,最终牙齿移动。以往的研究主要是探讨实验性牙移动时神经递质在牙周组织改建中的作用。但是正畸力在神经元中表达的信号传导机制并不是很明确。

神经元内的神经肽分泌一般机理是:在所有的真核细胞内,最终要释放到细胞外间隙的神经肽在粗面内质网内合成。新合成的蛋白首先进入细胞内的高尔基器内,蛋白质在此经历一系列翻译后修饰,然后转移到囊泡内,沿着微管被运输到轴突终末释放。大多数神经活性肽开始合成的并不是其最后分泌的形式,而是首先合成一种较大的无活性的神经肽前体蛋白。这种无活性的神经肽前体蛋白需水解成活性钛等小片段。泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway)是对细胞内的蛋白质进行降解的一条途径,它所介导的选择性蛋白质降解,是细胞调控的重要机制。L'O pez-Avalos等[2]学者对编码PGP9.5蛋白的cDNA进行测序并检测了组织分布,认为PGP9.5是一种广泛存在于神经元表达于细胞内的蛋白,是泛素C-末端水解酶(ubiquitz.in c-terminal hydrolases,UCH)的同工酶之一,可调节泛素化目标蛋白的降解速度[3]。

Vaska等[4]研究发现,实验牙齿移动第3天时PGP9.5免疫阳性反应神经纤维表达开始增加,第7天时表达最强,2周后开始趋于恢复至正常。本实验发现PGP9.5在牙齿移动过程中也呈现类似的时间变化规律,说明PGP9.5在牙周神经元中的表达与正畸压力有一定关系。正畸力的机械刺激可导致PGP9.5蛋白表达的增加和神经纤维的增生。而牙周神经PGP9.5的表达在加力3、7天阳性率最高,随之逐渐下降,这与Vaska研究结果不尽相同,推测可能是由于所采用的大鼠品系和正畸装置不同造成的。如由于正畸加力3～7天后上颌第一磨牙开始发生近中移动,且弹力线逐渐老化,导致正畸力值也相应逐渐减少。而由于根颈1/3处牙周神经较少,因此PGP9.5表达的改变并不明显。

结合本研究的结果和PGP9.5的生物活性,分析正畸牙移动过程中PGP9.5在正畸牙组织改建中的作用提示我们:PGP9.5的表达与牙周神经受到的正畸机械压力相关。正畸加力后大鼠牙周神经元细胞中PGP9.5表达增强,其加快神经肽的前体蛋白水解成活性肽的速度,进而增加神经肽的分泌。因此,在正畸牙移动过程中,泛素-蛋白酶体途径介导的细胞内神经肽前体蛋白的降解,调控神经肽的合成和分泌,可能是神经元细胞调控的重要机制。

有实验报道,成骨细胞的细胞系在体外可表达多种神经肽的受体,这些神经肽包括CGRP等,CGRP的成骨性刺激作用、以及它对骨吸收的抑制潜能,都通过体外和体内试验被证实[5]。有研究证实[6]:正畸加力可使牙周膜神经出现类似损伤性改变的应急反应。本研究也发现,实验牙齿移动7天后,压力侧的神经纤维的密度有所增加,近牙槽骨区可见沿着血管分布PGP9.5免疫阳性的神经纤维。与此同时,在牙槽骨表面出现类骨质的沉积,提示成骨活性的增加。神经的新生与大部分的活性牙周组织重建是同时进行的。这就提示:牙周神经纤维在正畸牙齿移动过程中,可能在调节骨细胞活性和促进类骨质的形成中发挥一定的作用。

牙周膜神经纤维出现在牙根的表面,与牙根的吸收同时发生。本实验也出现了这一现象:第7天和14天根吸收陷窝没有出现神经纤维,但是在第21天,PGP9.5免疫阳性的神经纤维在每个牙根的根吸收陷窝内和附近可见。在加力21天时,根吸收陷窝内的神经分布与牙周组织再生的活性是同时出现的。有学者报道说[7],在许多动物中机械压力造成牙根的吸收后,类骨质和类牙骨质的物质开始修复牙根吸收的部分区域。尽管他强调牙根吸收和牙根修复之间的广泛、系统的相互关系,但是他也发现,牙周感觉和交感神经可能也在这个过程中起到重要作用。段银钟等[8]等也认为外周神经参与局部牙周改建,尤其影响骨的形成。 因此,我们推测在一定的生理条件下,牙周神经纤维可能起到平衡硬组织形成细胞吸收和修复的作用,并因此为牙根表面提供一种保护作用。但是为了证实这种假说,我们有必要进行更多的实验。

牙周膜神经纤维在正畸牙移动过程中的分布变化提示我们,牙周神经在调节骨细胞活性和促进类骨质的形成、以及牙根吸收和修复等过程中可能也发挥重要作用。

[参考文献]

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[5]Vandevska-Radunovic V,Halskvinnsland l,Kuinnsland S,et al.Immunocompeten cells in rat periodontal ligamtnt and their retment incident to experimental orthodontic tooth movement[J].Eur J oral Sci,1997,105(1):36-44.

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[收稿日期]2009-12-30 [修回日期]2010-03-08