病毒性心肌炎慢性期Th细胞凋亡蛋白的表达以及清心Ⅱ号的干预作用

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刘宏飞　张　娟　娥航平

摘　要：目的：初步探讨病毒性心肌炎(Viral Myocarditis VMC)慢性期th细胞凋亡的部分调控机制，并观察清心Ⅱ号对这一环节的干预作用。课题的完成将为进一步阐明病毒性心肌炎的发病机制及清心Ⅱ号治疗本病的作用机理提供重要的实验依据。方法：按照文献方法建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型后，随机分为模型组和清心Ⅱ号治疗组，正常组和模型组给予蒸馏水灌胃，治疗组给予清心Ⅱ号水溶液灌霄。疗程结束后分别采集T细胞和Th细胞，透射电镜观察T细胞凋亡；运用流式细胞术擒测Th细胞凋亡；并用western-blot技术检测NF-kB，caspase-3，caspase-9蛋白在Th细胞上的表达。结果：(1)在VMC慢性期，各组均可见凋亡的T淋巴细胞，相对而言，模型组凋亡细胞数量较多。(2)与正常组比较，慢性期小鼠Th细胞凋亡显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，治疗组小鼠n细胞凋亡显著下降(P＜0.01)；治疗组与正常组相比较，两者之间无明显差异(P＜0.01)。(3)NF-KB，caspase-3，caspase-9蛋白在n细胞上的表达：与正常组相比较，模型组小鼠caspase-3，caspase-9和NF-KB蛋白在Th细胞上的表达有极显著差异；与模型组相比较：治疗组caspase-3和NF-kb蛋白表达受到明显抑制；而caspase-9的表达则未受到抑制。结论：病毒性心肌炎小鼠慢性期存在Th细胞过度凋亡的现象；清心Ⅱ号干预后Th细胞过度凋亡的现象受到抑制，这一作用的途径可能是清心Ⅱ号抑制了NF-kB，caspase-3在，Th细胞上的表达，但未显示出对cspase-9蛋白表达的抑制。

关键词：心肌炎；柯萨奇B3病毒；小鼠；细胞凋亡；清心Ⅱ号

目前认为病毒的直接溶细胞作用与感染后机体的免疫反应所致心肌损伤是病毒性心肌炎(Viral Myocarditis VMC)的主要发病机制，而Th细胞与机体免疫反应关系密切。清心Ⅱ号是本课题组在临床治疗VMC经验方清心饮的基础上经系统的研究而成的复方中药制剂。本研究旨在阐明VMC慢性期Th细胞凋亡的部分调控机制，并观察清心Ⅱ号对这一环节的干预作用。

1 实验材料

1．1病毒柯萨奇B，病毒(CVB3，Nancy株，HP-2细胞上测定TCIDS0=10-2)，由上海医科大学中山医院病毒性心肌炎重点实验室提供，本院心血管重点实验室超低温冰箱一80℃中冷藏。

1．2实验动物雄性Balb/c小鼠，4周龄，体重12-15g，共100只。购自中国科学院上海实验动物中心。

1．3实验药品 清心Ⅱ号水溶剂(由人参、丹参、苦参组成，专利申请号01103287)，本院制剂研究室提供。

1．4主要试剂和仪器AnnexinV-FITC/PI(美国BenderMedSystems公司)，蛋白分析仪(Beckman DU640)。Aotin抗体(Clone AC-74)，caspase-3单抗(Clone 31A1067)，NF-KB65p抗体，caspase-9单抗(ICE-lap6)，破膜剂(美国Caltag公司)，E1 XS00全自动酶标仪(美国Bio Tek)，LD4-2A低速离心机(江苏省苏州市医学器械有限公司)，EPICS*XL流式细胞仪(美国Beckman-Coluter公司)，JEM-1230透射电子显微镜(日本电子公司)。

2 研究方法

2．1模型建立与分组方法与分组：参照陈曙霞等慢性期造模方法，按照预试验估计20％死亡率，选取雄性Balh/c小鼠100只，随机分出正常对照组20只，剩余80只每只腹腔注射浓度为1:2000的含病毒生理盐水0.1mL之后，并在第14天以浓度为1:1000的含病毒生理盐水0.1mL，第28天以浓度为1:500的含病毒生理盐水0.1mL进行第2次，第3次腹腔注射，建立病毒性心肌炎慢性期小鼠模型后，再将存活小鼠随机分为模型组和清心Ⅱ号治疗组，每组20只。

2．2给药清心Ⅱ号(水溶剂)由本院制剂研究室提供，每毫升含原药3g，实验给药相当于成人剂量30倍，于第1次CVB3感染后42天灌胃，每次0.2mL，日1次，共45天。正常对照组、模型组给予相同体积的生理盐水灌胃。

2．3标本的采集和制备疗程结束后，各组小鼠采用拉椎处死小鼠，每组一半小鼠，取出脾脏，滤纸吸干血迹，标本置于2.5％戊二醛溶液中固定，供作电镜；每组另一半小鼠取脾脏，用生理盐水将脾细胞冲出后，收集脾细胞，将其悬于PBS液中待检测Th细胞。

2．4标本的检测电镜观察治疗前后脾脏T淋巴细胞凋亡情况；运用流式细胞术检测脾脏Th细胞凋亡；并用weotern-blot技术检测NF-kB，caspase-3，caspase-9蛋白在Th细胞上的表达。

2．5统计学分析计量资料采用；±s表示，应用SPSS11.5统计软件包进行统计分析处理，进行q检验，P＜0.05为差异具有显著性意义。

3 结果

3．1透射电镜观察结果在慢性期，各组均可见凋亡的T淋巴细胞，相对而言，模型组凋亡细胞数量较多。正常的T淋巴细胞核染色质分布均匀，胞质相对稀疏；而凋亡的T淋巴细胞容量减少。出现核染色质边聚，淋巴细胞空泡化，组织细胞吞噬现象，核形态不规则，部分萎缩的核破裂成一些球体。

3．2 Th细胞凋亡与正常组比较，慢性期小鼠Th细胞凋亡明显上升(P＜0.01)；与模型组比较，治疗组小鼠n细胞凋亡显著下降(P＜0.01)；治疗组与正常组之间有明显差异(P＜0.05)。

4 讨 论

细胞凋亡是机体在生长发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持体内环境平衡的自我调节机制。细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制，这种调节机制发生障碍和紊乱与多种疾病的发生、发展密切相关。在免疫反应过程中，大量活化的免疫细胞通过凋亡而不致于造成病理性堆积，从而下调免疫反应，减少免疫损伤；但过度的免疫细胞凋亡又可导致免疫缺陷。有研究发现VMC组脾脏细胞凋亡现象十分普遍，凋亡细胞散在分布，特别是动脉周围淋巴鞘区，T细胞活化旺盛，凋亡细胞亦较多见；而对照组则罕见凋亡现象。这表明在VMC的发病过程中，脾脏免疫细胞在活化的同时，也存在凋亡的发生。大量研究表明，凋亡发生是一个复杂的由caspases家庭成员介导的蛋白酶组联反应过程，即凋亡信号首先活化启动性caspases，进一步活化效应性caspases，然后作用

于底物蛋白，使蛋白分解引起凋亡。caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，而caspase-9介导细胞毒性的死亡信号。NF-kB是调节基因转录的关键因子之一，参与许多基因特别是与机体防御功能和炎性反应有关的早期应答基因的调控。有研究表明NF-kB活化可能参与了心肌细胞凋亡相关的信号传导。因此，对NF-kB及其活化过程的研究，并通过对其基因表达水平的调控来影响各种免疫细胞的功能活性，而成为许多顽固性疾病的治疗手段，可见，caspase-3、caspase-9、NF-kB在免疫细胞的凋亡中具有重要意义。

本文研究结果表明，在小鼠VMC慢性期，透射电镜观察可见凋亡的T淋巴细胞，相对而言，模型组凋亡细胞数量较多。对照本课题前研究结果发现：在急性期、恢复期、慢性期模型相对于正常和治疗组都存在T细胞过度凋亡的现象，经过清心Ⅱ号干预后透射电镜观察T细胞凋亡数量以及细胞形态大致接近于正常组而且111细胞也存在凋亡过度的现象(P＜0.01)，NF-Kb，caspase-3，caspase-9蛋白在Th细胞上的表达明显，这都一致表明在病毒性心肌炎的慢性期存在Th细胞的过度凋亡，并于T(h)细胞的过度凋亡中再现机体自身的免疫紊乱现象。经过清心Ⅱ号干预后，治疗组小鼠caspase-3和NF-kB蛋白在Th细胞上的表达受到抑制，和模型组比较有明显差异；而caspase-9的表达受抑制不明显，而且和模型组比较没有明显差别。因为caspase-3和caspase-9是影响细胞凋亡的两个不同的环节，两者的表达互相不受影响，因此可以认为清心Ⅱ号在病毒性心肌炎慢性期作用于细胞凋亡的执行酶caspase-3而使凋亡受到抑制，而对启动酶caspase-9的作用并不显著。对照同期急性期和恢复期研究：可以明显发现慢性期不同于前两期的作用环节。虽然NF-kb蛋白有抑制和促进细胞凋亡的双向作用，但在本实验中模型组小鼠NF-Kb蛋白明显表达时，并未显示出对Th细胞的过度凋亡(P＜0.01)有明显的抑制作用。(或者抑制作用不明显)。因此，可以认为，在VMC慢性期，NF-kb主要是促进细胞的凋亡，而治疗组小鼠的NF-kb蛋白表达受到抑制，也说明抑制NF-kb蛋白的表达可能是清心Ⅱ号作用于VMC慢性期另一个环节。

清心Ⅱ号是本课题组在我国国家级名老中医陆芷青教授10年治疗VMC经验方清心饮的基础上，进行了拆方、药效、药理、制剂工艺、质控标准、急慢性毒理等较系统的研究而成的复方中药制剂。方中人参具有益气养阴之效，切中病机，为方中君药；苦参性味苦寒，归心经，故能泻心经火而解热毒，两药相配合，一清一补，祛邪而不伤正；丹参《神农本草经》将其列为上品，《日华子本草》称其功能为“养神定志、通利关脉……治血邪心烦”，既可清热凉血，又可养血活血散瘀，安神宁心，与苦参同为方中臣药。丹参人心经又可作为使药，引诸药直达病所，诸药合用，恰合病机，达到扶正祛邪、标本兼治的效果。

本文研究观察了清心Ⅱ号对VMC小鼠慢性期Th细胞凋亡的干预作用。结果发现：清心Ⅱ号能够抑制caspase-3和NF-kb蛋白在Th细胞上的表达，从而抑制了Th细胞凋亡，从而积极控制疾病发展，避免或减免VMC向扩张型心肌病演变。上述实验结果进一步阐明了复方中药制剂清心Ⅱ号治疗VMC的作用机制，并为清心Ⅱ号作为一种良好的免疫调节剂应用于临床提供了重要的实验依据。