活血康脑胶囊中黄芪甲苷的提取工艺研究
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摘 要:目的:优选活血康脑胶囊制备工艺中黄芪提取过程中的有关工艺参数。方法:以黄芪甲苷含量为指标,HPLC法为测定方法,提取率为评价标准,采用重复正交实验法优化提取工艺。结果:乙醇浓度、提取时间、提取次数均对提取率有显著的影响,溶剂倍量影响不大。结论:黄芪最佳提取工艺条件为加8倍量90%乙醇,回流提取3次,每次1h。
关键词:活血康脑胶囊;黄芪甲苷;正交实验法
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0846-03
Study on Optimizing the Extraction Process of Astragaloside Ⅳ in Huoxue Kangnao Capsule
ZHANG Yuyan,YANG Jiehong,GE Lijun,WAN Haitong
(Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:To optimize the process paramets of extraction process of Astragaloside Ⅳ in Radix Astragali.Methods:The optimum extraction was investigated by the orthogonal design,the content of Astragaloside Ⅳ was used as index,and its extraction rate was used as evaluation standard, which determined by HPLC.Results:The concentration of ethanol,extraction time and extraction times have significant influence on the content of extraction rate,amount of ethanol has little influence.Conclusion:The optimum extraction of Astragaloside Ⅳ is:adding 8 times amount of 90% alcohol,refluxing and extraction for 3 times,1h each time.
Key words:Huoxue Kangnao Capsule;Astragaloside Ⅳ;orthogonal design
收稿日期:2009-10-28
基金项目:浙江省科技厅资助项目(2008C23063);浙江省中医管理局资助项目(2009ZA002)
作者简介:张宇燕(1976-),女,博士,研究方向:中医药学基础研究。
通讯作者:杨洁红(1969-),女,副教授,博士,主要从事方剂研究。
黄芪(Radix Astragali)为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。黄芪的主要成分有皂苷、黄酮及多糖、氨基酸等。黄芪苷Ⅳ(Astragaloside Ⅳ)又名黄芪甲苷,分子式(C41H68O14),属三萜皂苷类,是黄芪的主要成分之一。研究表明黄芪总苷具有免疫调节、抗炎降压、镇静镇痛、保肝、护心、清除多种自由基等作用[2-3]。常用醇提的方法来提取黄芪药材中的黄芪皂苷类成分,也常以黄芪甲苷作为评价黄芪及其制剂质量控制的重要指标。活血康脑胶囊是由黄芩、葛根、黄芪等多味药材提取有效部位群而制备的复方中药制剂,具有清热解毒,益气、活血、通络的功效,适用于缺血性中风中经络瘀阻脑络证。本实验以黄芪甲苷含量为指标,提取率为评价标准,考察选择黄芪有效部位最佳提取工艺,为制剂工艺研究提供实验依据。
1 仪器与试药
日本岛津高效液相色谱仪(包括SPD-10AVP紫外检测器,CLASS-VP色谱工作站);USC-202超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司);AG135电子天平(瑞士,梅特勒-托利多仪器有限公司)。
黄芪药材:购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司,经鉴定为蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var. mongholicus (Bge.) Hsiao的根;黄芪甲苷对照品(110781-200613):中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈为色谱纯,其余均为分析纯,水为超纯水。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:日本岛津VP-ODS C18(150mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%磷酸(32∶68);流速:1.0mL/min;紫外检测波长:205nm;柱温:30℃;进样体积:20μL;理论塔板数按黄芪甲苷计不低于4000。
2.2 黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定
精密称取黄芪粉末100g,用10倍量体积的2%KOH的乙醇液冷浸过夜,回流5次,每次2h,合并滤液,挥去乙醇,调PH至中性,调整体积至100mL,用乙酸乙酯提取3次(120、100、100mL),取水液用水饱和正丁醇萃取3次(150、120、100mL),正丁醇液用水洗涤2次,正丁醇液回收并挥干,残渣加色谱纯甲醇溶解并定容至50mL,高速离心,上清液过0.45μm微孔滤膜后用流动相稀释10倍,注入色谱仪测定,测定峰面积。实验结果黄芪甲苷的平均含量为10.80mg/10g(n=3)。
2.3 水提与醇提工艺比较
称取黄芪饮片10g两份,分别用10倍体积的70%乙醇和水,回流5次,每次1.5h,滤液定容至20mL,加2%KOH 20mL回流1h,滤液挥去乙醇,调PH至中性,其余按“黄芪药材提取液的制备、测定”项下方法制备,最后定容至5mL,过0.45μm微孔滤膜后稀释10倍,20μL注入液相色谱仪中,测定峰面积,根据回归方程计算并比较黄芪甲苷含量及提取率,结果见表1(n=2)。
表1黄芪甲苷水提与醇提工艺的比较
工艺样本数黄芪甲苷含量(mg/10g)黄芪甲苷提取率(%)
水提28.7180.62
醇提29.6589.33
实验结果表明,水提与醇提存在显著性差异(P
2.4重复正交实验法
以黄芪甲苷为指标,进行L9(34)的正交实验,正交因素、水平见表2,相同条件提取试验重复2次,正交试验结果见表3,方差分析见表4。
表2影响黄芪甲苷提取效果的4因素3水平表
水平因素
A乙醇浓度(%)B溶剂用量(倍)C提取时间(h)D提取次数
150611
27081.52
3901023
表3L9(34)正交试验表及结果
试验号ABCD黄芪甲苷提取率(%)
1111123.5247.86
2122223.0650.49
3133339.6134.07
4212329.2828.39
5223120.2621.73
6231258.0053.00
7313260.3852.54
8321391.5892.43
9332136.6731.69
Ⅰ218.615241.9685366.3961181.7359
Ⅱ210.6631299.5619199.5833297.4689T=794.56
Ⅲ365.2839253.0316228.5826315.3573C=35073.83
R154.620857.5934166.8128133.6213
Ⅰ247792.5358548.76134246.133027.95
Ⅱ244378.9489737.3439833.588487.73
Ⅲ2133432.364025.0152250.0199450.21
离均差平方和2526.811311.35882647.7791753.821
误差平方和745.3426
表4影响黄芪甲苷提取的方差分析
来源离均差平方和自由度方差F值显著性
A2526.81121263.40515.2556
B311.35882155.67941.879826>0.05
C2647.77921323.8915.98595
D1753.8212876.910410.58868
误差745.3426982.81584
结果分析:以黄芪甲苷的提取率为指标,则:
影响因素程度依次为C>A>D>B。A因素:极显著性因素,且Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ。
B因素:无显著性差异,Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ;
C因素:极显著性因素,且Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ;
D因素:极显著性因素,且Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ。
由上可见,最佳提取条件应为A3B2C1D3。
2.5 最佳工艺的验证
称取黄芪10g 3份,按最佳工艺提取,按上述供试品溶液制备测定方法,测定黄芪甲苷含量,计算提取率。结果见表5。
表5最佳工艺的验证
样品号黄芪甲苷得率(%)
192.32
291.51
392.00
结果表明,按最佳工艺提取出来的黄芪甲苷含量比正交实验中任何一次都高,表明最佳工艺可行。
3讨 论
(1)HPLC法测定黄芪甲苷简便快捷,精密度好,回收率高,已成为中药及其制剂质量监控的一种有效手段[4-7]。而黄芪药材中黄芪甲苷的含量很低,并且属于明显的末端吸收,仪器检测比较困难,易受溶剂干扰,需要对样品进行一系列前处理以减少干扰提高响应值。
活血康脑胶囊的制药组分黄芪中,所含有的黄芪苷(astragaloside)类成分的β-D-xylose上的乙酰基,在碱性条件下处理时,很容易水解掉,而变成Astragaloside Ⅳ,因此本试验采用经溶剂提取后,再用碱液处理,提高黄芪甲苷含量,再依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇液萃取、水洗涤进行纯化,减少测定时对黄芪甲苷的干扰。
实验结果表明本实验建立的提取、测定方法灵敏度高、快速、准确、简便、重现性好,可以用于黄芪及其制剂的质量控制。
(2)从表1可以看出,黄芪的水提和醇提工艺对黄芪甲苷的提取有较大的差别,且醇提法优于水提法,因此笔者采用乙醇作为提取溶剂进行工艺研究。
(3)从表3正交实验设计结果进行极差分析可见:以黄芪甲苷的提取率为指标,影响因素程度大小依次为C、A、D、B。对于A因素各水平Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ,B因素各水平Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ,C因素各水平Ⅰ>Ⅲ>Ⅱ,D因素各水平Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ,表明最佳工艺为A3B2C1D3。
(4)正交实验设计方差分析,误差平方和可以从两个途径计算得出,一是空列,二是重复实验。本实验为3水平4因素试验,用L9(34) 正交表,刚好将表格填满,没有空列进行误差分析。因此,笔者采用重复正交实验法(二次重复),以减少实验误差,提高实验的精确程度[8]。
从表3正交实验设计结果进行方差分析,C、A、D均有极显著性差异(P0.05),即6倍、8倍、10倍溶剂体积对黄芪甲苷的提取率没有显著性影响,所以选择极差分析结果,也即常用8倍溶剂。
总结以上实验结果,活血康脑胶囊中黄芪甲苷的最佳提取工艺条件为加8倍量90%乙醇,回流提取3次,每次1h。
参考文献
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