铜绿微囊藻挥发性成分分析

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收稿日期:2009-12-02.

基金项目:国家自然科学基金（30960036）;云南省自然科学基金（2007C001M）.

作者简介:邓国宾（1969-），男，博士.主要研究方向：植物生理与分子生物学.

通讯作者：陈小兰（1975-），女，博士,讲师.主要研究方向：藻类生理生化及抗逆.

摘要:采用同时蒸馏萃取装置提取收集并用气相色谱-质谱联用仪对铜绿微囊藻挥发性成分进行了分离和鉴定，分离并鉴定了67种化合物，占总峰面积的85.11%，其中分离出烃类、酮类、醇类、酚类、酯类、醛类、酸类，杂环类8大类化合物.在所分离鉴定的挥发性成分中，其百分含量在1.00%以上的化合物10种，分别为：丁酸、十六酸、十七烷、豆蔻酸、圆柏酸内酯、邻苯二甲酸二丁酯、植物醇、1-乙基-1，5-环辛二烯、2-戊烯-1-醇、1-戊烯-3-醇.为进一步研究铜绿微囊藻挥发性成分的组成和影响机制及危害提供基础数据.

关键词:铜绿微囊藻；同时蒸馏萃取；气相色谱-质谱法；挥发性成分

中图分类号:Q949.22

文献标识码:A文章编号:1672-8513(2010)04-0285-05

Analysis of the Volatile Compounds of Microcystis Aeruginosa Kuitz with the Gas Chromatography-Mass Spectrometry

DENG Guobin1,HE Yaoying2,XUE Hongfen1，

TANG Xiaoli1,YANG Mingzhi1，CHEN Xiaolan1[JZ)]

(1. Plant Research Center of Life Science School，Yunnan University，Kunming 650091，China; 2. College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract: The volatile compounds of Microcystis aeruginosa Kuitz were prepared with simultaneous distillation and extraction equipment (SDE). They were isolated and identified with the capillary GC-MS method. The 68 volatile components were analyzed and determined，accounting for 85.11% of the total area of the peak，including eight classes of hydrocarbons，ketones，alcohols，phenol，ester，aldehyde，acid，and heterocyclic compounds. Among them，ten kinds of components surpassing 1 percent of the total area of the peak were butanoic acid，n-hexadecanoic acid，heptadecane，tetradecanoic acid，juniperic acid lactone，dibutyl phthalate，phytol，1，5-cyclooctadiene，1-ethyl-1-，2-penten-1-ol，and 1-penten-3-ol. Fundamental data for studying the formation mechanism and prevention of water bloom were accumulated in this paper..

Key words: Microcystis aeruginosa Kuitz; simultaneous distillation and extraction equipment(SDE); GC-MS; volatile compounds

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa Kuitz)，属蓝藻门微囊藻属.铜绿微囊藻是形成滇池水华进而对生态环境造成严重影响的主要藻类.迄今，人们对铜绿微囊藻进行的相关研究，主要针对水体理化因素与微囊藻水华发生关系研究和生物因子对微囊藻水华影响研究进行了报道［1-6］.水华蓝藻带来的恶臭和空气污染也是其重要危害之一，挥发性物质在水体生态系统种间关系中起着重要作用［7-10］.但目前对其挥发性化学成分的组成、影响因子及生态作用研究还较少.本实验将来自于滇池铜绿微囊藻FACHB905通过富集培养后，利用同时蒸馏萃取其挥发性成分进行收集，并用GC-MS对其进行了分析，鉴定出了67种挥发性成分，其中分离出烃类（16种，12.02%）、酮类（6种，1.67%）、醇类（8种，4.63%）、酚类（3种，0.17%）、酯类（12种，12.36%）、醛类（8种，1.05%）、酸类（11种，52.70%），杂环类（3种，0.51%）8大类化合物，为进一步研究铜绿微囊藻挥发性组成及影响因素奠定基础.

1 实验部分

1.1 仪器与材料

SHZ-3型循环水真空泵（河南巩义市豫华仪器厂）；DL302型调温调湿箱（WTCbinder）；电热水浴锅（北京泰克仪器有限公司）；恒温培养摇床（东联电子技术开发有限公司）；GC-MS(6890/5972)仪（美国Agilent公司）；同时蒸馏提取器（自制）；恒温培养箱（湖北黄石市医疗器械厂）；BUCHIR-3000型旋转蒸发仪（瑞士）；超净工作台（昆明金京田科贸有公司）.无水硫酸钠；二氯甲烷；硝酸钠；磷酸氢二钾；柠檬酸；硫酸镁；氯化钙；硼酸；碳酸钙；EDTA等(市售).滇池水体铜绿微囊藻藻种FACHB905(源于昆明滇池，由中科院武汉水生生物所淡水藻种库分离、鉴定与提供).

1.2 实验方法

1.2.1 铜绿微囊藻富集

将铜绿微囊藻FACHB905接种在用BG11培养基［9］中，在(25±1)℃，2500l x光强，12h光照、12h黑暗光周期下进行培养.每7d继代扩大培养1次.收集OD680在3以上的培养液共10L用于分析，离心收集藻细胞.

第4期 邓国宾，何耀莹，薛红芬，等：铜绿微囊藻挥发性成分分析

云南民族大学学报（自然科学版） 第19卷

1.2.2 铜绿微囊藻挥发性成分的收集

取收集到的新鲜藻细胞50g，放入同时蒸馏萃取装置一端的500mL圆底烧瓶中，加入250mL蒸馏水，用电热套加热；装置的另一端为盛25mL二氯甲烷的100mL圆底烧瓶，在60℃下水浴加热，同时蒸馏萃取3h.二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，置于4℃过夜，过滤，滤液倒入浓缩瓶中用Vigreux柱浓缩至约1mL，浓缩液用于GC-MS分析.

1.2.3 GC-MS分析

GC-MS分析测试条件：色谱柱：HP-5MS(60m×0.32mm×0.25μm)；载气：He；流速：1mL/min；进样温度：240℃；接口温度：250℃；质谱扫描范围：35~455amu；离子源：EI源；电子能量：70eV.按此分析测试条件，对滇池水体铜绿微囊藻挥发性成分进行分析，各化合物质量分数的确定为面积归一化法.化合物定性分析是根据GC-MS联用所得质谱信息经计算机用Wiley,NISt98谱库与标准谱图对照、解析，最终确认其中的化学成分.

2 结果与讨论

按上述色谱-质谱条件对滇池水体铜绿微囊藻挥发性成分进行分析，获得的总离子流图见图1.经分析确定的化合物及其相对百分含量示于表1.

所确定的化合物有烃类、酮类、醇类、酚类、酯类、醛类、酸类以及其他类8大类化合物.它们的种类和相对含量见表2.酸类化合物中，饱和酸9种(52.45%)，分别为：丁酸(29.78%)、十六酸(13.02%)、豆蔻酸(7.87%)、2-甲基丁酸(0.71%)、3-甲基丁酸(0.45%)、丙酸(0.27%)、十五酸(0.22%)、2-甲基丙酸(0.07%)、戊酸(0.06%)，不饱和酸1种(0.12%)，即Z-11-十四碳烯酸(0.12%)，酸酐化合物1种(0.13%)，即月桂酸酐(0.13%)；烃类化合物16种，烯烃类5种(1.54%)，分别为：3-甲基环己烯(0.01%)、α-紫罗烯(0.02%)、长叶烯(0.01%)、8-十七碳烯(0.06%)、1-乙基-1，5-环辛二烯(1.44%)，烷烃类9种(10.38%)，分别为：1，4-二甲基环己烷(0.02%)、降植烷(0.01%)、十五烷(0.07%)、十六烷(0.14%)、十七烷(9.85%)、7-甲基十七烷(0.08%)、十三烷(0.2%)、二十五烷(0.04%)、十八烷(0.05%)，卤代烃2种(0.02%)，分别为：五氯乙烷(0.01%)、六氯乙烷(0.01%)；酯类化合物12种（12.36%），分别为：圆柏酸内酯(5.14%)、二氢猕猴桃内酯(0.06%)、亚硫酸二（2-异丙基-5-甲基环己基）酯(0.17%)、邻苯二甲酸二异丁酯(0.86%)、邻苯二甲酸二丁酯(3.61%)、邻苯二甲酸二辛酯(0.11%)、乙酸(4-乙苯基)酯(0.02%)、柠檬酸三乙酯(0.08%)、豆蔻酸乙酯(0.28%)、十六酸乙酯(0.94%)、亚麻酸甲酯(0.36%)、亚麻酸乙酯(0.73%)，其中内酯有2种二氢猕猴桃内酯(0.06%)、圆柏酸内酯(5.14%)，含硫酯内化合物1种，即亚硫酸二（2-异丙基-5-甲基环己基）酯(0.17%)；醇类化合物8种（4.63%），分别为：1-戊烯-3-醇(1.04%)、乙醛缩二乙醇(0.05%)、3-甲基-1-丁醇(0.12%)、2-戊烯-1-醇(1.23%)、2，6-二甲基环己醇(0.04%)、β-苯乙醇(0.66%)、E-2-十四碳烯醇(0.03%)、植物醇(1.46%)；酮类化合物6种(1.67%)，分别为：3-戊酮(0.45%)、2，2，6-三甲基环己酮(0.02%)、二氢化-β-紫罗兰酮(0.15%)、β-紫罗兰酮(0.19%)、六氢法呢基丙酮(0.30%)、(3E，5E，7E)-6-甲基-8-(2，6，6-三甲基-1-环己烯基)-3，5，7-辛三烯-2-酮(0.56%)；醛类化合物8种（1.05%），分别为：3-甲基-2-丁醛(0.02%)、苯乙醛(0.03%)、3，4-二甲基苯甲醛(0.06%)、藏花醛(0.07%)、β-环柠檬醛(0.28%)、β-环高柠檬醛(0.02%)、2-甲基-4-(2，6，6-三甲基-1-环己烯)基-2-丁烯醛(0.06%)、E-11-十六碳烯醛(0.51%)；酚类化合物3种(0.17%)，分别为：对甲苯酚(0.07%)、丁化羟基甲苯(0.07%)、4-叔丁基间甲苯硫酚(0.03%)；杂环类化合物3种(0.51%)，分别为：环戊并［c］噻喃(0.06%)、2-乙基-1，6-二氧杂螺［4.4］壬烷(0.03%)、十四烷基环氧乙烷(0.42%).

在所分离鉴定的挥发性成分中，其百分含量在1.00%以上的化合物10种，占总峰面积的74.44%，分别为：丁酸(29.78%)、十六酸(13.02%)、十七烷(9.85%)、豆蔻酸(7.87%)、圆柏酸内酯(5.14%)、邻苯二甲酸二丁酯(3.61%)、植物醇(1.46%)、1-乙基-1，5-环辛二烯(1.44%)、2-戊烯-1-醇(1.23%)、1-戊烯-3-醇(1.04%).这10种化合物中有些物质可能在种间关系中起重要作用，如邻苯二甲酸二丁酯［11］.

在所分离鉴定的烃类挥发性成分中，有五氯乙烷、六氯乙烷2种卤代烃，这2种卤代烃都是有毒成分，它们对环境是具有危害的.

挥发性物质的组成受藻细胞本身的遗传特性和生存的外界环境因子的影响，本研究对实验室纯培养的铜绿微囊藻细胞释放的挥发性成分进行了研究，对其受环境因子的影响还将在今后的工作中开展，这两方面的研究将有利于进一步了解挥发性成分在水华蓝藻爆发和种间关系中的作用.

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