土壤拮抗放线菌的分离与筛选效果研究
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摘要 针对青海地区不同类型的土壤进行放线菌的分离、筛选。结果表明，10-3倍土壤稀释浓度为分离放线菌的最佳土壤稀释浓度；重铬酸钾是一种高效、方便、廉价的杂菌抑制剂，共筛得102株形态各异的放线菌，有32株菌分别对9种指示菌有较强的拮抗性，26株对不同细菌有较强抑菌活性，6株对真菌有抑菌活性，其中第24号放线菌对不同的指示菌的拮抗性最好。
中图分类号 Q939.13+2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）17-0225-02
农用抗生素作为生物农药，以其高效、低毒、无残留等优点在农作物病虫害防治中发挥着重要作用[1-2]。放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物，目前从微生物中发现的大约8 000种生物活性物质中，近70% 是由放线菌产生的[3]。自然界中，尤其是土壤中，放线菌资源异常丰富。据统计分析，1 g土壤中通常含有1 000万个放线菌，因此开发土壤中的放线菌一直是研究的热点，目前已取得很大的成就。该试验从青海省采集的土壤中分离、筛选出1株具较强抑菌活性的放线菌N24，为拮抗放线菌资源在无公害生物农药的研发与应用提供了一些基础数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试待分离土样。曲阜师范大学实验室于2012年8月在青海省不同地区、不同生态环境中的枸杞植被根部的挑选采集了4份土壤样品材料，并把每个标准地土壤剖面的同一层次的土样混合后立即转入无菌的塑料袋中带回实验室。
1.1.2 供试菌株。金黄色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉、木霉、根霉均由曲阜师范大学实验室保存。
1.1.3 供试培养基及试剂。高氏一号培养基：用于菌株分离、培养性状观察及保藏。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基于120 ℃高压灭菌30 min，放置备用，用于拮抗性测定和培养性状观察。LB培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，琼脂1.5%[4-5]。
1.1.4 仪器及设备。主要有w202B升降恒温水浴锅、高压灭菌锅、SW-CJ-2FD洁净工作台、血球计数板、pH试纸、打孔器等。
1.2 试验方法
采集土样预处理放线菌的分离菌株纯化琼脂块法初筛杯碟法复筛选取抑菌性菌株。
1.2.1 土壤样品预处理。取土壤表层以下5～10 cm处的土样。进行预处理，自然条件下风干7 d，再用3种不同的物理、化学等方法对样品进行预处理。
1.2.2 制备土壤稀释液（无菌操作）。一是称取土样5 g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中（玻璃珠大约30粒），振荡30 min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。二是用移液枪吸取10-2的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可制成10-4的稀释液（每个稀释度换用1个枪头，每次吸入土液后，要将枪头插入液面，吹吸3次）。
1.2.3 放线菌的分离。
（1）涂布。每份土样各取10-2、10-3、10-4稀释液100 mL，用移液枪严格按照无菌操作要求，加入对应编号培养皿中，然后用无菌的涂布棒在平板上将悬浮液轻轻涂布均匀[6]。
（2）平板划线分离微生物。使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，目的是获得单个菌落。
（3）纯化。从培养后的第3天起，根据菌落形态、气生菌丝特点等挑选放线菌单菌落，将生长成熟的菌落及时用无菌接种针挑取到高氏一号培养基斜面，培养7～14 d后检查。同一土壤样品在不同培养基上分离到的不同放线菌菌株统一编号后，在4 ℃冰箱暂时斜面保存。
1.2.4 抑菌活性测定。每种拮抗菌都有自己的抗菌谱。抗菌谱的测定可以为拮抗菌的使用范围提供试验依据。选用金黄色葡萄球菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉、木霉、根霉9种菌作为检定菌，采用传统的琼脂块法进行初筛，以杯碟法进行复筛，来筛选对金黄色葡萄球菌等9种指示菌具拮抗活性的放线菌，记录其编号，并分别转接到相应分离培养基斜面上保存[7]。
（1）拮抗放线菌的初筛。将保存的放线菌菌株活化后，采用琼脂块法[8]进行筛选：将供试放线菌涂布接种在高氏一号培养基平板上，置于28 ℃培养8 d，用打孔器（直径=8 mm）将其切成菌块，将供试病原菌用无菌水配制成菌悬液（6×108～9×108 cfu/mL），取100 μL分别涂布在PDA与LB培养基上，制成含菌平板，每个处理重复3皿。以不加放线菌菌饼作为对照，细菌置37 ℃培养箱培养1 d后测量抑菌圈的直径，真菌置28 ℃培养箱培养3 d后测量抑菌圈的直径（mm）。
（2）拮抗放线菌的复筛。选择在初筛中拮抗性好的放线菌，将菌株的孢子接种于高氏一号合成培养基斜面上，28 ℃培养5 d，待孢子生长成熟后，4℃保存备用。挑取活化菌种，接入装有20 mL种子培养基的100 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min条件下培养24 h作为种子液。取l mL种子液接入装有50 mL发酵基础培养基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min条件下振荡培养5 d。然后将发酵混合物经过双层灭菌滤纸进行初次过滤，再通过滤膜再次过滤，所得液体即发酵液，用于后续试验。离心收集发酵上清液，抑菌活性的测定采用杯碟法[9-10]。
将指示菌分别涂布在PDA培养基上，将牛津杯放于培养基上方，每个培养皿中放4个。取200 μL制备好的发酵液加到牛津杯中，放于培养箱中培养，1 d后测量细菌和真菌的抑菌圈直径。
2 结果与分析
2.1 放线菌的分离结果
对从青海省不同地区不同生态条件下采回的土壤样品进行了放线菌的分离，共分离到放线菌102株，编号为N1～N102。在高氏一号培养基上，这些放线菌株表现了不同的培养性状，多数菌株的正面是灰色、白色、淡黄色、褐色等，背面培养色泽有灰色、灰白等，主要呈球形和棒状等，生长快慢也不一致，表现了丰富的多样性。
2.2 初筛结果
对于102株放线菌，除32株菌分别对9种指示菌有一定的抑菌活性，其余70株放线菌对9种供试菌均无抑菌活性，其中对5种细菌都具有强的拮抗活性的有26株，对4种真菌具有拮抗活性的有6株，具体数据见表1。部分菌株仅对其中的一种或几种指示菌有活性，表明这些拮抗菌株表现抑菌活性时有一定的选择性。从筛选到的初步表现拮抗活性的32株放线菌菌株中选取20株进行下面的摇瓶复筛试验。
2.3 拮抗放线菌的复筛结果
通过摇瓶试验对初筛得到的20个菌株进行复筛，结果表明，20个菌株在高氏一号液体培养基中培养的培养液，其中，对5种细菌的平均抑菌圈直径≥10 mm的菌株有3株，即N24、N76、N93，其中菌株编号为N24的菌株的发酵液对7种指示菌表现出强的抑菌活性（表2）。
2.4 抑菌谱测定结果
由表3可知，N24菌株发酵液的抗菌谱较广，对金黄色葡萄球菌具有较强抑制作用，平均抑菌圈直径达到18 mm 以上，对其他供试菌也呈现出不同程度的抑制作用。目前正在进行抗菌物质的分离、纯化及结构鉴别等工作，以期为该菌株及其抗菌物质的应用提供依据。
3 结论与讨论
试验的过程中通过对土壤进行风干、研磨、加热等预处理，可以有效地降低土壤中细菌与真菌的数量，同时可以促进放线菌孢子的萌发率，从而提高放线菌的出菌率。为了防止在纯化放线菌时细菌与真菌的干扰，在培养基中加入重铬酸钾（50 μg/mL）作为抑菌剂。通过该种方法最终获得了大量形态各异的放线菌，通过拮抗性试验选出了32株具有拮抗性作用的菌株，其中24号菌效果最好，为今后研究抗生素提供了优良的菌株。放线菌的发酵工艺研究对工业化生产农用抗生素有重要意义，因此，今后对放线菌N24进行发酵条件优化试验，将为进一步的中试及大规模生产提供必要的理论依据。
土壤是微生物生长发育的良好环境，拮抗菌的主要来源是土壤。由于微生物在土壤中的分布，受各种生态因子的综合影响而有极其显著的差异。所以要获得尽可能多样化的各种放线菌菌株，必须要采集不同生态条件下的各种土壤进行分离。要寻找某些稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌等，也可以采集海水、湖泥、堆肥等进行分离。本试验对青海高原土壤放线菌进行分离筛选，筛选到的菌株抑菌效果各不相同，这与土样的来源、分离方法、指示菌本身的特点及放线菌的抑菌能力等因素都有一定的关系。
4 参考文献
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