花生赤霉素2―氧化酶基因的克隆和表达研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇花生赤霉素2―氧化酶基因的克隆和表达研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：赤霉素2-氧化酶（GA2ox）是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶，催化有活性的赤霉素生成无活性的赤霉素。从花生荚果发育不同时期的转录组序列中筛选到GA2ox的基因片段，采用5′-RACE方法克隆了花生GA2ox基因的全长cDNA序列。序列分析表明，花生GA2ox蛋白氨基酸序列含有和其他植物同样保守的结构域。通过qRT-PCR技术对GA2ox基因在花生不同组织器官中的表达分析，发现所检测的10种组织中均有GA2ox的表达，其中成年叶片中表达最丰富，根、刚入土的果针次之。本研究结果为进一步分析该基因在花生生长发育过程中的作用提供了有用信息。
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0014-05
赤霉素（gibberellins， GAs）是一类四环双萜类的植物激素，具有生物活性的赤霉素在高等植物种子萌发、茎伸长、开花诱导及种子和果实的生长等过程中起着重要作用。植物也可以通过调节内源赤霉素的生物合成介导自身对环境因子的应答[1，2]。自1935年首次成功分离出赤霉素以来，已经发现一百多种赤霉素分子，但仅有GA1，GA3和GA4等少数具有生物学活性[3，4]。
多种酶参与植物体内赤霉素的生物合成，GA2-氧化酶（gibberellin 2-oxidase， GA2ox）是在赤霉素合成途径中起负调控作用的一种关键酶，GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，使两者在C-2位羟基化转变成无活性的GA8和GA34[5]。在植物中豌豆的GA2ox （SLN）最早被克隆，其编码蛋白能催化GA1、GA4和GA20生产相应的2β羟基化产物，它一般在花、根和种皮中表达[6，7]。目前，多种高等植物的GA2ox基因已经被克隆和研究，结果表明GA2ox基因一般以基因家族的形式出现。GA2ox家族可以分为3类，第一类和第二类作用于C19-GAs（GA1和GA4），使之失活，或使其前体（GA9和GA20）失活；第三类作用于C20-GAs，使之2β-羟基化，这类基因包括（AtGA2ox7-8和SoGA2ox3）。后来的研究发现菠菜的GA2ox1可以同时作用于C19-GAs和C20-GAs[9]。这些研究结果表明植物中存在两种具有不同特异性的GA2-氧化酶。
GA2ox催化GAs进行羟基化反应使植物体内GA含量降低。在烟草中过量表达AtGA2ox7-8会使赤霉素含量降低，产生矮化表型[8]。在拟南芥中过量表达GA2ox可以使植株出现矮化，而且使开花时间延长，影响种子的育性等[10～12]。本研究通过转录组测序和RACE技术首次从花生中克隆得到AhGA2ox基因，并对该基因进行生物信息学分析，对该基因在花生不同组织器官中的表达进行研究，为今后研究花生荚果发育过程中赤霉素合成调控以及赤霉素信号传导的作用奠定了基础。
1材料与方法
11试验材料
以鲁花14花生品种为材料，大田栽种，日常管理，收集不同发育时期的根、茎、叶、花、果针、荚果和种子，用于RNA提取。
12试验方法
121cDNA 合成与高通量测序提取不同发育时期花生荚果的总RNA，用Agilent 2100检测提取RNA样品的质量与纯度，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。将来自于入土生长0、3、10天的花生果针mRNA等量混合，加入破碎缓冲液将mRNA打断成短片段（ 200～700 nt ），以mRNA为模板，用随机引物合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H（Invitrogen）和DNA 聚合酶 Ⅰ（New England Biolabs）合成cDNA第二链，经纯化后做末端修复，加poly（A）并连接测序接头，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。
122数据分析得到测序结果后，将原始数据去除接头得到clean reads，用SOAPdenovo软件将clean reads进行无参考基因组拼接，最终得到unigenes。对得到的unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 等数据库进行BlastX （E value
123AhGA2ox基因克隆提取鲁花14果针的RNA，利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）试剂盒反转录得到花生果针cDNA。根据转录组测序获得的GA2ox基因片段，设计5′-RACE引物：outer：GGTGGCACTGAAACCCAAC
TCCTATCTC；inner：GGAGGGTAATGGTTGAGCCTGAAGACTG。
以cDNA为模板进行RACE扩增。PCR程序为：第一轮：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25个循环；72℃ 5 min。以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增，PCR程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min。
分析测序结果后设计克隆AhGA2ox全长引物：AhGA2oxF： CTTGTGTGTG TTCTAACTTCCA，AhGA2oxR： CCTATGACGCCACGACTT，以花生cDNA为模板扩增AhGA2ox基因全长。
124AhGA2ox基因序列分析利用Premier 50设计PCR引物。AhGA2ox基因的同源性分析使用NCBI的在线分析工具Blastn和Blastp；Expert Protein Analysis System在线服务用于分析AhGA2ox基因的编码蛋白；使用在线软件ProtScale（http：//usexpasyorg/cgi-bin/protscalepl）对AhGA2ox蛋白的疏水性进行分析； 用TMHMM和SignalP分别对AhGA2ox跨膜结构和信号肽区域进行预测；利用CluscalW和MEGA50进行AhGA2ox基因的多序列比对并构建进化树。
125qRT-PCR分析qRT-PCR反应以花生不同发育时期的cDNA作模板，以组成型表达的花生AhActin基因作为内参，目的基因和内参基因引物序列为：AhGa2oxF： ACCCACATTCCCTACATCC， AhGA2oxR： GACCTTGAAGAAGCCATAGTC， AhActinF： GTCATCGTCATCCTCTTCTC， AhActinR： CATTCCTGTTCCATTGTCAC。采用FastStart SYBR Green试剂盒（Roche）按说明书进行操作。
用ABI PRISM 7900HT实时定量PCR仪进行反应，反应程序为：步骤1预变性95℃ 10 s；步骤2两步法扩增95℃ 5 s，60℃ 1 min，40个循环；步骤3熔解曲线95℃ 0 s，60℃ 15 s，95℃ 0 s。每个反应管均设置重复管，重复试验3次。根据溶解曲线检测PCR产物的特异性。基因表达水平通过 2-CT 方法计算。
2结果与分析
21AhGA2ox基因全长的获得
通过转录组测序，总共获得了72 527 条unigenes。序列聚类分析和BlastX比对结果显示其中一条820 bp的序列注释为GA2ox，与其他植物GA2ox基因相比5′端缺少大约380 bp，利用RACE技术获得该序列的5′-末端，拼接后设计引物克隆获得AhGA2ox的全长开放阅读框（ORF）1 014 bp （图1）。
22AhGA2ox蛋白序列分析
利用Expert Protein Analysis System在线服务对AhGA2ox进行分析，结果表明AhGA2ox编码的蛋白含338个氨基酸，分子量为379 kD，等电点为844。由序列分析可知，该蛋白含有20种氨基酸（表1），疏水性氨基酸占453%，亲水性氨基酸占386%，碱性氨基酸占13%，酸性氨基酸占98%。其中有16个含S氨基酸。
将花生GA2ox的序列与其他10种植物GA2ox蛋白序列进行同源比对，发现不同物种间GA2ox的同源性较低，花生与其它植物的GA2ox只有60%左右的相似性（图2）。为了确定AhGA2ox的进化位置，用11种植物GA2ox氨基酸序列构建系统进化树（图3），结果显示花生GA2ox与同属豆科的红豆GA2ox和豇豆GA2ox亲缘关系较近。
使用TMHMM在线预测分析后发现，AhGA2ox不存在信号肽序列和跨膜结构，预示该蛋白在细胞内不会发生迁移，该结果与DNS（http：//mendelimpacat/sat/DNS/DNShtml）的在线服务预测结果一致。用Predict Protein（http：//wwwpredictproteinorg）网络服务器对AhGA2ox编码的蛋白进行可溶性分析，结果表明有582%的氨基酸残基暴露在外，可与溶剂接触，可判断该蛋白为可溶性蛋白。利用predict protein在线服务对AhGA2ox进行二级结构预测，结果表明在GA2ox蛋白中，螺旋结构占2493%，折叠结构占1632%，环肽链占5875%。GA2ox与2-酮戊二酸相结合的保守序列，基本由折叠结构和环肽链结构组成。
利用Expasy的ProtScale在线预测AhGA2ox的疏水性（图4），结果表明该蛋白的疏水性最大值为2322，最小值为-2344。从图中可以看出，AhGA2ox编码蛋白的疏水区域与亲水区域是交替出现的，在第180个氨基酸附近的疏水区域可能与GA2ox的功能结构域有关。
23AhGA2ox的表达模式分析
本研究通过qRT-PCR方法检测了AhGA2ox的表达情况，AhActin为参照基因。结果表明，花生GA2ox在果针、花、茎、叶、根、种子中都有表达（图5）。根据该基因各个组织的Ct值，经2-ΔΔCt法处理数据后发现AhGA2ox在成年期植株的叶中表达量最高，其次，在根及入土3天的果针中表达也相对较高，表达量最低的是成年的茎。
1：未入土果针；2：入土3天果针；3：入土9天果针；4：花；
5：成年期茎；6：幼年期茎；7：成年期叶；8：幼年期叶；9：根；10：种子
3讨论
GA2-氧化酶是在赤霉素合成过程中催化生物活性赤霉素失活的关键酶[13]，在小麦、番茄、烟草等植物中异源表达AtGA2ox会使植株矮化[14～16]。GA2-氧化酶基因属于20G-Fe（Ⅱ） oxygenase superfamily基因家族，其中拟南芥中鉴定了8个不同的GA2ox基因[17]，大豆中注释GA2ox的有7个基因。1999年Martin等[18]人在豌豆中鉴定了两个GA2ox的cDNA，2003年Agrawal等鉴定了两个水稻GA2ox基因。
本研究克隆得到花生的一个GA2ox基因，通过对这个基因的生物信息学分析，可以确认它是GA2ox基因家族中的一员，是一种氧化还原酶类的双加氧酶，以2-酮戊二酸为底物，催化赤霉素失去生物活性。AhGA2ox具有该蛋白家族共同的结构特点，含有保守的20G-FeⅡ-Oxy蛋白结构域，还有高度保守的与2-酮戊二酸结合位点（Arg-272、Ser-274）和Fe2+结合位点（His-205、Asp-207、His-262），这表明AhGA2ox属于GA2-氧化酶家族。
研究表明，拟南芥8种GA2ox基因表达模式有所不同，如AtGA2ox1和AtGA2ox2在花、茎和荚果中表达量高，在叶中表达量低；而AtGA2ox3在这些组织中检测不到表达。我们对花生GA2ox表达分析研究发现，在花生幼年期的各组织中表达量较低，而在成年期的叶片和根中表达量较高。赤霉素在植物生长发育过程中起重要作用，而AhGA2ox表达模式的不同暗示AhGA2ox通过负调控赤霉素合成，在花生不同发育时期、不同组织中起作用。另外，在花生荚果发育过程中，果针入土后3天时GA2ox的表达量明显升高，暗示赤霉素在花生荚果发育初期起到重要的调控作用。
参考文献：
[1]Hedden P， Phillips A I Gibberellin metabolism：new insights revealed by the genes [J] Trends in Plant Science， 2000，5（12）：523-530
[2]Olszewski N， Sun T P， Gubler F Gibberellin signaling： biosynthesis， catabolism， and response pathways [J] Plant Cell， 2002， 14（S1）：S61S80
[3]Silverstone A L， Sun T P Gibberellins and the green revolution [J] Trends Plant Sci，2000，5：1-2
[4]Gao X H， Xiao S L， Yao Q F， et al An updated GA signaling ‘relief of repression’ regulatory model [J] Molecular Plant，2011，4（4）：601-606
[5]Ross J J， Reid J B， Swain S M，et al Genetic regulation of gibberellins deactivation in Pisum [J] Plant J，1995，7：513-523
[6]Martin D N， William M P， Hedden P Mendelp’s dwarfing gene：cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins [J] Proc Nat Acad Sci USA， 1997，94（16）：8907-8911
[7]Lester D R， Ross J J， Smith J J， et al Gibberellin 2-oxidation and the SLN gene of Pisum sativum [J] Plant J，1999，19（1）：65-73
[8]Schomburg F M， Bizzell C M， Lee D J， et alOverexpression of a novel class of gibberellin 2-oxidases decreases gibberellin levels and creates dwarf plants [J] Plant Cell，2003，15：151-163
[9]Lee D J， Zeevaart J A Differential regulation of RNA levels of gibberellin dioxygenases by photoperiod in spinach [J] Plant Physiology， 2002，130（4）：2085-2094
[10]Lin C C， Chu C F， Liu P H Expression of an Oncidium gene encoding a patatin like protein delays flowering in Arabidopsis by reducing gibberellin synthesis [J] Plant Cell Physiology，2011，52（2）：421-435
[11]Zhao X Y， Yu X H， Foo E，et al A study of gibberellin homeostasis and cryptochrome-mediated blue light inhibition of hypocotyl elongation [J] Plant Physiology，2007，145（1）：106-118
[12]Otani M，Yoon J M， Park S H Screening and characterization of an inhibitory chemical specific to Arabidopsis gibberellin 2-oxidases [J] Medicinal Chemistry Letters，2010，20（14）：4259-4262