HPLC法测定葶苈降血脂片中熊果酸含量的探讨
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摘 要：目的：建立葶苈降血脂片中熊果酸的含量的测定方法。方法：采用高效液相色谱法．色谱柱为ZORB-AX SB－C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，检测波长为215mm，流动相为甲醇－水－醋酸铵－乙腈(9:25:0.8:65)，柱温为室温，流速为1.0mL・min-1。结果：熊果酸的含量在72－360μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9995，平均回收率为100.3％(n=5)。结论：方法操作简便，快速，结果准确可靠。
关键词：hplc法；葶苈降血脂片；熊果酸；含量测定
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1504－02
葶苈降血脂片，由葶苈子、山楂、茵陈、黄芩、泽泻、大黄、木香7味药物提取精制而成。具有宣通导滞、通络散结、消痰渗湿的功能，可用于高脂血症。其中山楂为药食两用的药材，为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E. Br．或山楂Crataegus pinnatifida Bge的干燥成熟果实，具有消食健胃、行气散瘀的功效。据文献报道，山楂中含有熊果酸等三萜类成分。研究发现其具有较显著的免疫作用和抗促癌，抗致癌。诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用。原质量标准为薄层扫描法测定样品中熊果酸的含量，操作复杂，且受诸多不易控制因素影响，如薄层板的均匀性，点样的准确度，层析时的蒸汽饱和度，温度，喷显色剂的量和均匀度，显色时温度差异，相对湿度等，直接导致定量分析结果重现性，精密度，稳定性欠佳。为了更加有效、方便控制其内在质量，确保其疗效，在参考文献资料及实验研究的基础上建立了样品前处理简单，操作方便，快速，结果准确可靠的高效液相色谱法测定本制剂中熊果酸的含量，并参考文献中的流动相，选择并优化色谱条件等，现介绍如下。
1 仪器和试剂
Aglent 1100 series型高效液相色谱仪(美国)。Agilentaerial泵及VWD检测器。SB2200－T型超声波清洗器。BS－210S型电子天平(德国)。熊果酸对照品(供含量测定用)由中国药品生物制品检定所提供；葶苈降血脂片(规格每片0.3g，批号：20041006，20020301，20020303)由福建某药业有限公司提供。甲醇、乙腈均为色谱纯。水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
2 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB－C18(4.6mm×150mm，5μn)；流动相：甲醇－水－醋酸铵－乙腈(9：25：0.8：65)；检测波长：215nm。柱温为室温；流速为1.0mL・min-1；样量为10μL；熊果酸色谱峰与相邻峰之间的分离度大于1.5；理论塔板数按熊果酸的峰计不低于5000。
3 溶液的制备
3．1 对照品溶液取熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.072mg的溶液。
3．2 供试品溶液取本品36片，除去包衣，精密称定。研粉，精密称定约10g，置碘量瓶中，加乙醚120mL，超声提取约3h，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。即得。
4 方法考察
4．1 线性关系精密量取3．1项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度。按上述色谱条件，进样10μL，进行测定。回归方程为A=1625.8C－6.138，r=0.9995结果表明熊果酸含量在为72－360μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
4．2 重复性试验取20041006批样品5份，每份约11g。精密称定，均按“3．2”项下方法制成供试品，并在上述的色谱条件下测定，测得熊果酸峰面积积分值的RSD为2.2％(n=5)。表明重复性良好。
4．3 精密度试验同一供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积RSD=1.6％(n=5)，表明精密度良好。
4．4 回收率试验取已知含量的葶苈降血脂片(批号：20041006)5份，各取18片，去包衣，研粉，精密称定约5g，于每份中分别精密加入1mL熊果酸对照品溶液(精密称取8.53mg对照品，置10mL容量瓶中，甲醇定容)，挥去甲醇，按“3．2”项下方法提取，制备供试液，并在上述的色谱条件下测定含量，记录色谱图，计算熊果酸回收率，见表1。结果表明回收率高。
4．5 稳定性试验同一供试品溶液，按上述色谱条件，定时进样测定，分别在0、2、4、8、24h进行测定，测得供试品中熊果酸峰面积积分值的RSD=2.6％(n=5)。结果表明在24h内供试品溶液是稳定性良好。
4．6 阴性试验按上述色谱条件，吸取对照品溶液、供试品溶液及缺山楂“3．2”项下方法制备的阴性溶液各10μL进样检测。在供试品色谱中，与对照品色谱谱相应的位置上有着相同保留时间的色谱峰，而阴性溶液在此保留时间无峰干扰(见图1)。
4．7 样品测定取本品3批，按“3．2”项下方法制备供试品溶液并按上述色谱条件，对照品溶液与供试品溶液各进样10μL，分别测定熊果酸含量，见表2。
5 讨 论
先后用甲醇一水一冰醋酸一三乙胺(83：17：0.04：0.01)、甲醇一水一冰醋酸一三乙胺(85:15:0.04:L0.01)、甲醇－水－冰醋酸－三乙胺(75:25:0.04:0.01)、甲醇－水－醋酸铵－乙腈(9:25:0.8:67)为流动相，但主峰分离效果均不理想。最后采用甲醇－水－醋酸铵－乙腈(9:25:0.8:65)为流动相实验，所得熊果酸峰形良好，分离度较高，基线较平稳，并且柱效高，阴性对照无干扰峰。
实验过程中曾参考文献选用210、220nm作为检测波长，但其稳定性及灵敏度均不及215nm，故最终采用215nm作为检测波长。
熊果酸为非极性的五环三萜酸，可溶于氯仿、甲醇、乙醇、丙酮，不溶于水和石油醚。而齐墩果酸也为三萜酸，且极性与熊果酸极为接近，山楂中含有熊果酸与齐墩果酸，这样必然导致在薄层板上很难将两者分离开来。本实验采用高效液相法可将葶苈降血脂片中山楂的熊果酸峰与齐墩果酸峰完全分离且操作简单、快速、精密度高、重复性好、结果准确可靠，优于原质量标准熊果酸含量测定，可做为该制剂的质量控制。