蓝莓多糖的提取及分离纯化的研究

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摘要：蓝莓作为人体抗氧化第一卫士的水果，有对衰老、癌症和心脏疾病的抗氧化能力，另外还可以解除眼睛疲劳，改善视力。除此之外,还能延缓脑神衰老，增强记忆力，还有就是可以预防尿道感染。因此受大家越来越大的重视。蓝莓果实更是加工的上好原料，可制成果酱、蜜饯、糖果、冰淇淋等，蓝霉在食品行业还是有很大研究价值的。而其中作为有效成分之一的多糖，渐渐进入人们视野。现今，国内外对多糖的研究比较深刻，已经意识到多糖对于医学等生命科学领域中的重要性。因此，关于蓝莓多糖的研究更是成为了热门研究对象。最佳提取工艺为添加纤维素酶反应时间为10min,温度40℃添加量为0.6%，多糖所得率2.319%。用Sevage法脱蛋白，最佳脱蛋白率为0.045%所得多糖量最多，为86.53846。脱色素的最佳双氧水添加量为30%pH值为9.0氧化时间为3h，温度50℃。在此条件下提取和纯化效果最好。

关键词：蓝莓；多糖；提取；纯化

[中图分类号]S663.9 [文献标识码]A [文章编号]1009-9646（2012）4-0035-04

随着人们生活水平的不断改善，人们对健康越来越重视，对疾病的预防也有很大认识。蓝莓作为新兴具有保健功能的浆果已走进人们的视线，其必将掀起一股热潮。

我国对蓝莓的加工还处于起步阶段，主要是鲜食和生产速冻产品，深加工产品也不多，主要开发蓝莓汁饮料、蓝莓酒和蓝莓果酱产品。由于蓝莓特有的活性成分，今后我们开发产品还要考虑其生物功能，研究新产品。

目前国际市场上开发利用的蓝莓生物功能主要是花色苷的提取物，对于多糖研究不多。而蓝莓色素有其自身缺陷，多糖的兴起成为必然。

本文主要在以下方面开展研究工作：

（1）将传统水浸液与酶法提取等提取技术应用于蓝莓多糖的提取研究，对比出蓝莓多糖提取的最佳方法，最终确定其最佳工艺参数。

（2）对蓝莓的脱色方法进行研究，并确定最佳脱色工艺。

（3）对蓝莓多糖脱蛋白方法进行研究，确定脱蛋白工艺。

本实验的研究特点和创新：

目前国内外对于蓝莓的研究正蓄势待发，对于蓝莓多糖的研究还未见报道。从提取花色苷后的蓝莓残渣中再提取多糖物质，再利用一些化学制剂分离纯化多糖，这不仅降低了成本，节省能源消耗，还能提高蓝莓产品的商业价值。

本课题主要是对蓝莓多糖的提取和分离纯化进行了科学研究。

一、材料与方法

1.材料与仪器

材料：沈阳农业大学食品学院脱色以后的蓝莓，品种是辽宁蓝金实业有限公司的北陆；生化级，国药集团化学试剂有限公司出品的酶活性1500u/g的纤维素酶，双氧水、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇、丙酮等为分析纯，蒸馏水。

仪器：粉碎机，上海世邦有限公司；7200型可见分光光度计，尤尼柯（上海）有限公司；电热恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；TDL-5000B型离心机，上海安亭科学仪器厂；RE―52型旋转蒸发仪，上海博通经贸有限公司；SHZ―IIIB型循环水真空泵，上海华琦科学仪器有限公司；数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司。

2.实验研究内容与方法

（1）多糖含量的测定：精密称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖2.559g，定容至500mL容量瓶中；吸取3mL溶液定容于100mL容量瓶中，得到浓度为0.1024mg/mL的标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于25mL具塞比色管中，加蒸馏水补充至1.0mL；摇匀，分别加入5%的苯酚溶液1.6mL，浓硫酸7mL；40℃水浴中放置0.5h，冷却至室温。另取1mL蒸馏水，加同量苯酚和浓硫酸，同法操作，制成空白对照样。溶液在493.5nm处测定吸光度，以吸光度(y)对葡萄糖的浓度(X)进行回归方程的计算。

准确称取多糖样液1.0ml，再加5%苯酚1.6ml和浓硫酸7.0ml，其他按照标准曲线做，测吸光度。将所得结果代入回归方程就可得出多糖含量。样品多糖所得率（%）=多糖含量/样品干重00%

（2）多糖的提取工艺：树莓残渣粉碎加水60倍搅拌调pH值加纤维素酶100℃灭酶15min水浸1h 3000r/min离心10min醇沉80% 3000r/min离心10min丙酮,乙醇洗涤抽滤真空干燥得粗多糖

传统水浸提法：树莓残渣粉碎加水60倍搅拌调pH值温度在90水浸4h过滤除蛋白脱色真空干燥得粗多糖

第一次水提的多糖提取率为2.33%，粗多糖(干重)的提取率为6.82%.第二次酶提的多糖提取率为0.64%，粗多糖(干重)的提取率为1.11%，分别占二次总提取量的21.5%和14%；而在相同条件下无酶提取，提取率仅为0.39%和0.56%。酶法相对无酶水提法提取率分别增加63.3%和98.9%.研究表明，此方法的多糖总提取率达2.97%，粗多糖(干重)的总提取率为7.93%.采用超声波辅助酶法提取多糖时，第二次提取的多糖提取率为0.67%，比单独酶解法高4.1%，但考虑到设备投资成本，工业化生产不宜采用。用酶法提取得到的多糖仍具有较强的抑制a一淀粉酶酶活的活性。

（3）多糖的分离纯化工艺：多糖脱色脱蛋白透析冷冻干燥乙醇沉淀离心分离乙醚，丙酮洗涤DEAE-52纤维素柱层析SephacrylS- 300柱层析纯度鉴定。

蛋白去除率的计算蛋白去除率（%）=除蛋白后的所得提取液重量/除蛋白前的提取液重量00%

脱色率的计算对蓝莓提取液进行可见一紫外光全波长扫描。结果表明，溶液无最大吸收波长。由于枣多糖溶液脱色前后均为橙黄色，故从溶液的互补色考虑选择450nln为检测波长测定其吸收度。并按下式计算脱色率。脱色率=（脱色前吸光度脱色后吸光度）/脱色前吸光度00%

（4）单因素及正交实验酶法优化的单因素实验：选三个对多糖提取影响显著的因素，分别用时间80、100、120、140min；温度30、40、50、60℃，加酶量0.4%、0.6%、0.8%、1.0%进行实验。双氧水脱色的单因素实验：四个对脱色影响显著的因素，分别为双氧水添加量25%、30%、35%、40%；pH值为8、8.5、9、9.5；反应时间2、3、4、5h；温度为30、40、50、60℃四个水平进行实验。

正交实验酶法优化正交实验：根据单因素实验结果，以L9（33）做正交实验，得酶法优化实验结果。双氧水脱色正交实验：遵照单因素实验结果，按L9(34)做正交实验，得出脱色最佳条件。

二、结果和分析

1.数据处理和分析运用MicrosoftExcel应用程序和DPS数据处理系统进行数据处和分析。

酶解反应所得数据:

2.多糖含量的标准曲线

按照本试验方法，所得标准曲线见Fig.1，回归方程为：y=6.8369x+0.0897,r=0.9990

3.纤维素酶与多糖提取量的相关性分析

（1）酶解时间对多糖产量的影响。随着酶解时间的推移,多糖产量不断攀升,在120min是最高蜂;不过随着时间进一步增加,多糖产量反而出现下降。出现这一现象的主要原因可能是酶解时间短，反应不充分；反应时间过长，对于多糖的结构会引起一些变化，可能导致碳链裂解以至于多糖产量的降低。因此，酶解反应的最佳时间为120min。

（2）酶解温度对多糖产量的影响。酶解温度可以说是酶解反应最为显著的影响因素了。在酶解时间和纤维素酶添加量相同条件下，多糖的产量呈不断增加趋势，在40℃达到峰值，以后呈下降趋势。导致这一现象的原因是由于随着温度升高，反应速率也随之提升；而当温度过高，超出酶的最适温度就会造成酶蛋白的变性，失活，从而使多糖产量降低。所以酶解温度以40℃为宜。

（3）酶的添加量对多糖产量的影响。酶的添加多少直接影响反应速率。相同的酶解温度和酶解时间下，酶的添加量越多，多糖产率越高，在0.6%达到最大值；之后随着添加量的继续加大，多糖产量逐渐减少。这是因为纤维素酶是作用于底物，随着多糖的溶出底物越来越少，这样就使一部分酶不能充足与底物结合，产量因此降低；与此同时纤维素酶破解了细胞壁网状结构，细胞内溶物大量流释，使多糖溶解度降低，从而使产量也随之降低。所以酶添加量选择0.6%。

4.蛋白去除率与多糖产量的相关性分析

蓝莓粗提的多糖经过20次Sevage法脱蛋白处理后其结果如图2，在前15次减少的幅度很大，蛋白脱除率达85%，之后变化不大。

相关性分析

5.双氧水条件的相关性分析

（1）双氧水添加量对脱色率的影响。双氧水有很强的氧化性，双氧水的添加量直接反应出脱色的效果。双氧水不断增加，脱色率也随着增加；在40%是最大值。所以选择添加量为40%。在此条件下脱色效果最理想。

（2）双氧水pH值对脱色率的影响。双氧水pH值对脱色率的影响也很大。在偏碱性条件下氧化效果比较好。随着pH值的升高，脱色率也升高。但在pH为9.5脱色最好，因此pH调为9.5条件下进行双氧水脱色。

（3）双氧水氧化时间对脱色率的影响。双氧水的氧化时间直接影响脱色率。氧化时间越长，那么氧化反应越充分，氧化效果越好，脱色率自然也高。反应时间在5h脱色率最大，所以选氧化时间为5h。

（4）双氧水温度对脱色率的影响。双氧水的温度对氧化反应影响也很大。双氧水温度越高，其他条件相同情况下，脱色率越高，但是在50℃达到最高值后反而有所下降。分析其原因可能是由于双氧水温度越高，氧化反应速率越快；峰值之后，温度过高破坏了色素的结构，从而使脱色率降低。所以采用50℃脱色。

三、结论与讨论

1.结论

通过由单因素实验和正交实验所得实验数据的处理以及实验结果的分析，不难看出酶的添加量是影响提取的最大因素，酶法提取蓝莓多糖的最佳条件为0.6%的酶添加量，温度在40℃，时间是100min。在此条件下蓝莓多糖的产率为2.319%，比传统水浸提法在提取温度、时间都减少很多，而且操作简便，能耗小，产量高。对于双氧水脱色来说，最佳条件是双氧水添加量为40%，pH值为9.5，温度为50℃，反应时间为5h。在这样的条件下，脱色率最高。常规的活性炭脱色法，虽然操作可行，但存在脱色后溶液中的活性炭残渣难于完全除去L8J的问题；另外，因pH值需调至3.5左右，所以酸的用量较大，还需配置搅拌设备以及离心设备，设备投资费用较高。双氧水脱色工艺所需设备较常见，溶剂用量少，脱色效果较好，存在的问题是需要较低的温度；树脂脱色工艺简单，缺点是一次性投资较大，且需再生使用，生产周期较长。两种方法各有利弊，均适用于工业化大生产。

2.讨论

蓝莓多糖的提取和纯化在目前来讲，可以说是一项新的课题，由于没有现呈的科学依据，仅仅翻阅了一些相关联的参考资料，文刊、论文、书籍等。所以实验难免存在瑕疵，因为实验条件的限制，实验所得结果可能存在问题。对于蓝莓多糖的研究还很肤浅，蓝莓的生物价值以及医学价值非常高，关于蓝莓多糖的作用说法不一，而蓝莓多糖的类型、结构等目前还没有新的发现。所以关于蓝莓多糖提取和纯化还有待日后的验证。

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熊名红，毕业于西南大学应用化学系，现在重庆市涪陵计量质量检测中心从事食品分析工作。

秦秀蓉，毕业于重庆教育学院化学系，现在重庆市涪陵计量质量检测中心从事食品分析工作。

冉建军，毕业于重庆党校法律专业，现在重庆市涪陵计量质量检测中心从事检验工作。