抗HBV-DC联合药物治疗e抗原阳性的临床研究

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[摘要]目的 观察HBsAg致敏自体外周血单个核细胞（PBMC）来源的树突状细胞联合拉米夫定和胸腺肽α1治疗HBeAg阳性慢乙肝的临床效果。 方法 HBeAg阳性CHB患者20例接受临床研究。取肝素抗凝外周静脉血50mL，以密度梯度离心及贴壁法获得PBMC，GM-CSF和IL-4诱导扩增DC，第6天给予30 μg的HBsAg致敏DC，第7天收获抗hbv-dc。联合拉米夫定和胸腺肽α1，分别于0、4、12周检测HBVM定量和HBV-DNA定量及肝功能。 结果 全部患者治疗后4、12周的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA均明显下降。总有效率100%（20/20）。 结论 抗HBV-DC联合拉米夫定和胸腺肽α1治疗，可快速降低血中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，促进HBeAb的产生，提高HBeAg/HBeAb的血清学转换率。

[关键词] 树突状细胞；慢性乙型肝炎；乙肝疫苗

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）01-077-03

Preliminary clinical study of anti-HBV-DC combine lamivudine and thymosin α1 treat the HBeAg positive chronic hepatitis B patients

LIU Yong WU Bangfu HU Yuanyuan

Gastroenterology and Hepatology Center, Southern Medical University Renkang Hospital, Dongguan 523952, China

[Abstract] Objective To observe the clinical treatment effects of the HBsAg pulsed autologous dendritic cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) combine lamivudine and Thymosin-α1 for the HBeAg positive chronic hepatitis B patients. Methods Twenty patients with HBeAg positive CHB accepted by clinical research. Taking peripheral venous blood 50mL, by density gradient centrifugation and adhesion method to obtain PBMC, GM-CSF and IL-4 induced expansion of DC. At the sixth days, a 30 μg HBsAg was give to pulse the DC. At the seventh days, the anti-HBV-DCs. All patients were Lamivudine dosed every day, and were injected thymosin-α1 by subcutaneous, The HBVM, HBV-DNA and liver function were respectively detected at 0,4,12 weeks. Results At 0,4,12 weeks, the serum HBsAg levels, the serum HBeAg levels and the serum HBV-DNA levels were significantly decreased. The total effective rate was 100% (20/20). Conclusion The anti-HBV-DC by subcutaneous and intravenous injection combine lamivudine and Thymosin-α1 can decrease rapid the serum HBsAg, HBeAg and HBV-DNA levels, promote to the HBeAb production, and enhance the HBeAg/HBeAb seroconversion rate.

[Key words] Pulsed autologous dendritic cells; HBsAg; Hepatitis B vaccine

机体免疫系统对HBV产生免疫耐受是人感染HBV后慢性化的主要原因。形成免疫耐受的原因可能有多种因素参与，而树突状细胞的功能缺陷是形成免疫耐受的重要原因之一。以HBsAg致敏自体外周血单个核细胞来源的DC治疗慢性HBV感染者已取得一定的效果。我们前期的临床研究也证实[1]，负载HBsAg的抗HBV-DC可以快速降低或清除慢性HBV感染者的病毒抗原，促进HBeAb的产生，加速HBeAg/HBeAb的血清学转换。但是，在抑制病毒复制和减少病毒载量方面相对缓慢。目前广泛使用的核苷类抗病毒药物可以快速抑制HBV复制和降低病毒载量，但在降低或清除病毒抗原、促进HBeAb的产生和促进HBeAg/HBeAb的血清学转换方面较缓慢。胸腺肽α1具有增强非特异性免疫功能，是目前唯一被推荐用于慢乙肝治疗的免疫调节类药物，但是单独应用的疗效较差。为提高以抗HBV-DC为主的免疫治疗方法的临床效果，我们在应用抗HBV-DC治疗的同时，联合应用拉米夫定和胸腺肽α1治疗HBeAg阳性CHB患者，取得了较好的效果，现报道如下。

1材料与方法

1.1 研究对象

根据2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》和2005年12月制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的标准，随机选取南方医科大学仁康医院2010年6～12月住院的HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者20例，其中男15例，女5例，年龄15～45岁，平均30岁。病程1～20年，均为轻度的慢性乙型肝炎患者。ALT：（46～276） U/L，ALT≤2倍正常值者11例，ALT＞2倍者9例，平均101.85 U/L。1例为HBsAg、HBeAg及HBV-DNA阳性；19例为HBsAg、HBeAg、HBcAb及HBV-DNA阳性，其中1例合并丁型肝炎病毒（HDV）感染，HDV-IgM和HDV-RNA阳性。

试验符合南方医科大学仁康医院人体临床试验伦理学标准，并得到医院伦理委员会的批准。试验开始前所有患者均签署了知情同意书。

1.2 抗HBV-DC培养方法

取患者肝素抗凝的外周静脉血50 mL，以密度梯度离心及贴壁法获得单个核细胞。在37 ℃、5%CO2浓度的条件下，用含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4等细胞因子的RPMI1640培养基诱导PBMC中的贴壁细胞，扩增出DC。于培养第6天给予含有30 μg HBsAg的商用乙型肝炎疫苗致敏DC，使其成为具有特异性治疗CHB的DC疫苗，简称抗HBV-DC；于培养第7天收获DC，并以生理盐水洗涤2次，获得（0.5～1.0）×106的抗HBV-DC，以2 mL生理盐水悬浮备用。

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1.3 治疗方案

将以2 mL生理盐水悬浮的抗HBV-DC皮下和静脉各注射1 mL，每2周1次，共6次。拉米夫定（安徽贝克，批号：101102）100 mg/日，口服。胸腺肽a1（海南中和，批号：H20051916）1.6 mg皮下注射，每周2次，共24次。所有患者均不使用降酶药物。

1.4 标本检测

于治疗开始的0、4、12周，即抗HBV-DC回输前、回输2次和6次后的第14天，分别以时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）检测HBV标志物（HBVM）定量，以荧光定量PCR检测HBV-DNA定量，同时检测ALT及总胆红素（TBIL）等肝功能指标。

1.5 统计学处理

采用治疗前后自身对照，以SPSS15.0进行统计学处理。数据以（χ±s）表示，差异显著性检验采用配对样本t检验，确定当P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后HBVM及HBV-DNA定量改变

所有患者在治疗4周和12周时的血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA水平均较治疗前明显下降。4周时，HBsAg平均下降65.83%，无HBsAg转阴；HBeAg平均下降78.95%，其中7例HBeAg转阴（35%），但这7例中有1例在12周时HBeAg又转阳；HBV-DNA平均下降2.15个对数值。12周时，HBsAg平均下降77.79%，仍无HBsAg转阴；HBeAg平均下降83.11%，另有3例HBeAg转阴，共有9例HBeAg转阴（45%）；HBV-DNA平均下降2.26个对数值。

4周时，有12例HBeAb较治疗前升高，其中9例HBeAb转阳(45%)，但这9例中有4例在12周时HBeAb又转阴；另3例升高者中有2例在12周时HBeAb转阳。1例4周时HBeAb下降为零，12周时又升高，但未转阳。7例4周时HBeAb无变化，治疗前后均为零，但这7例中有4例在12周时HBeAb升高，其中2例转阳。12周时共有9例HBeAb转阳(45%)，见表1。

2.2 应答反应

4周时，出现单项病毒学应答者14例（70%）,其中HBV-DNA转阴11例（55%），下降3例。6例出现HBeAg/HBeAb血清学转换，转换率30%（6/20），1例在12周时又出现HBeAg转阳和HBeAb转阴。5例出现单项生化学应答，ALT恢复正常（25%）。共有17例出现部分应答（85%），无完全应答者。

12周时，另有4例出现单项病毒学应答者，其中HBV-DNA转阴和下降各2例，18例出现单项病毒学应答者（90%），其中HBV-DNA转阴13例（65%）。另有4例出现HBeAg/HBeAb血清学转换，9例出现HBeAg/HBeAb血清学转换，总的转换率为45%（9/20）。另5例出现单项生化学应答，ALT恢复正常，10例ALT恢复正常（50%）。12周时7例出现完全应答（35%），13例出现部分应答（65%），总应答率（有效率）为100%（20/20）。

2.3 肝功能改变与应答的关系

治疗4周时，17例ALT较前下降，其中5例ALT降至正常。3例较前升高，但12周时下降。治疗12周时，所有患者的ALT均较治疗前下降，其中10例ALT降至正常。

4周时出现HBeAg/HBeAb血清学转换的6例中，2例治疗前ALT＞2倍正常值，4例ALT≤2倍正常值，但是，这4例中1例在12周时再转为HBeAg阳性和HBeAb阴性。12周时达到HBeAg/HBeAb血清学转换的9例中，5例治疗前ALT＞2倍正常值，占ALT＞2倍正常值患者的55.56%（5/9）；4例ALT≤2倍正常值，占ALT≤2倍正常值患者的36.36%（4/11）。

2.4 不良反应

抗HBV-DC皮下注射后2例次出现注射部位的皮肤红肿，未做特殊处理，数日后自行消退。抗HBV-DC注射后4例次出现头痛和轻、中度发热，均未做任何处理，次日消退。总的不良反应率为5%。没有患者因为不能耐受的不良反应而停止治疗。

3 讨论

已知的树突状细胞（DC）是人体最强的抗原呈递细胞，它专职负责摄取、加工、处理及传递病原微生物及癌变细胞等非己抗原的信息给下一级免疫细胞，启动机体的抗感染及抗肿瘤免疫，因此，DC是机体抗感染及抗肿瘤的免疫启动者。国内外大量的基础研究表明，乙肝的慢性化与人体的免疫系统对乙肝病毒发生免疫耐受有关[3]，而免疫耐受主要原因是慢性乙肝病毒的DC功能低下，主要表现为不成熟，不能有效地将乙肝病毒感染的信息传递给T淋巴细胞，也不能有效地为T淋巴细胞的活化提供刺激信号，使免疫系统不能产生特异性地细胞毒性T淋巴细胞和特异性抗体来清除乙肝病毒，导致乙肝的慢性化。通过体外培养技术，可以获得大量活化、功能基本正常并携带乙肝病毒抗原信息的DC。将其回输后可以使免疫系统重新恢复对乙肝病毒的免疫识别，安全或者部分打破免疫耐受，重启抗乙肝病毒的免疫反应

人体临床实验表明：以HBsAg致敏慢性HBV感染者PBMC来源自体DC细胞，将该DC回输患者，显示能够抑制HBV的复制[4]，部分患者HBV-DNA、HBsAg及HBeAg转阴。早期临床研究显示[6]，体外诱导扩增慢性HBV感染者自身PBMC来源的DC并经HBsAg致敏后使其成为具有特异性治疗慢性HBV感染的抗HBV-DC，将其静脉回输，可有效地抑制慢性HBV感染者的病毒复制，减少病毒载量，显著降低或者清除病毒HBsAg和HBeAg，促进HBeAb产生，促进HBeAg/HBeAb的血清学转换，部分乙肝患者彻底治愈。慢性乙型肝炎HBeAg阳性患者可对抗HBV-DC的治疗发生良好的应答反应[6]，是一种安全有效的治疗慢性HBV感染者的免疫学治疗方法，显示出良好的应用前景。将抗HBV-DC回输技术与核苷类似物和胸腺肽α1等药物联合应用[7]，发现可以进一步提高疗效，明显高于单纯药物治疗的疗效。

[参考文献]

[1] 吴邦富，杨江英，周，等. 自体树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的初步临床试验[J].中国当代医学，2008,15（4）：22-24.

[2] 中华医学会肝病学分会，感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2010版）[J]. 临床肝胆病杂志，2011，27（1）：1-16.

[3] 拉青. 乙肝五项测定对乙型肝炎诊断意义的探讨[J]. 中国医药科学，2011，1（18）：50-51.

[4] Min Chen, Yong-Guo Li, Da-Zhi Zhang,et al. Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: A clinical study[J]. World J Gastroenterol，2005,11（12）：1806-1808.

[5] 吴邦富，杨江英，周，等. 抗HBV-DC治疗e抗原阳性慢性HBV感染者的初步临床研究[J]. 中国现代医生，2007，45（15）：1-2,9.

[6] 段学章，庄辉. 树突状细胞(DC)疫苗治疗慢性乙型肝炎的展望[J]. 传染病信息，2003，16（4）：163-165.

[7] 李爱霞，孔令振，李洁. 恩替卡韦治疗的抗原阳性慢性乙型肝炎的近期疗效观察[J]. 临床合理用药杂志，2009，2（9）：51-52.

（收稿日期：2011-10-21）

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