1对脓毒症小鼠CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的干预效应'> 胸腺肽α1对脓毒症小鼠CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的干预效应

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇1对脓毒症小鼠CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的干预效应'> 胸腺肽α1对脓毒症小鼠CD4+CD25+Foxp3+ T细胞的干预效应范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

严重脓毒症和脓毒症休克，是危重患者最主要的死因[1]，同时抗菌素滥用导致的负面影响日益严重[2-3]。近年来发现免疫紊乱是脓毒症发病的重要机制，但对免疫调节治疗却充满争议 [4]。胸腺肽α1 （thymosin-α1，Tα1 ）具有强大的免疫调节活性[5]，已越来越多地应用于危重患者[6]；调节性T细胞（以下简称Treg）与脓毒症免疫紊乱密切相关，其中最具代表性的是CD4+CD25+Foxp3+ T细胞 [7-8]。为了解Tα1与Treg间的相互关联，本实验以盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture， CLP）脓毒症小鼠模型为对象，观察Tα1对脓毒症小鼠血液中CD4+CD25+ Foxp3+T细胞占T淋巴细胞比例，及对细胞因子、模型72 h生存率以及CD4+CD25+ T细胞凋亡的影响，探讨Tα1与Treg间的交叉对话机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验在第二军医大学上海长征医院急救科实验室完成。选用清洁级雄性KM小鼠，体质量30～35 g[购自第二军医大学实验动物中心（SCXK2007-0003）]。按随机数字表法将动物分为假手术组（Sham）、脓毒症组（CLP）和Tα1干预组（Th）。3组均按术后拟定标本采集时间点随机分为2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 共6个亚组，前5个亚组每组20只小鼠，72 h亚组30只小鼠；分别于上述各时间点对各亚组存活小鼠经心脏采血后处死；记录72 h亚组小鼠生存时间。

1.2 CLP脓毒症模型制备

根据预实验调整手术方法，维持CLP小鼠72 h生存率约50%。3%戊巴比妥钠1.5 ml/kg腹腔注射麻醉后剃除中下腹部披毛；消毒铺巾；取中下腹正中切口1.0 cm打开腹腔，小心钳取盲肠；分离出盲肠末端用4-0线结扎其远端1/3，并在结扎之远端肠管中部用12-0针头贯穿2处，见少许肠内容物溢出后还纳腹腔，关腹；术毕于腹部皮下注射生理盐水50 ml/kg补充术中体液丢失。

1.3 假手术处理

手术准备同上，打开腹腔后小心翻动肠管1～3次，不进行盲肠结扎和穿孔，关腹，术毕于腹部皮下注射生理盐水50 ml/kg。

1.4 Tα1干预处理

按前述方法完成CLP手术，术毕予Tα1（日达仙TM，意大利）100 μg/kg加入到容量为50 ml/kg的生理盐水中腹部皮下注射。

1.5 标本采集

小鼠于拟定时间点以手术麻醉剂量1/3～1/2的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经皮心脏采血后处死，收集全血分为2份以备流式细胞检测和细胞因子检测。

1.6 流式细胞检测

1.6.1 cd4+cd25+foxp3+三阳性Treg细胞检测 新鲜EDTA抗凝全血，800 r/min离心5 min，弃上清；按细胞沉淀体积的5倍容积加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解5 min；800 r/min 4 ℃离心5 min，弃红色上清；如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤1次；加入5 ml PBS，吹打混匀后1200 r/min离心5 min，洗涤，弃上清，加入PBS细胞计数，调整细胞含量到1×106 ml-1。分别加入PE-Cy5 anti-mouse CD4 （eBioscience， 美国）、PE anti-mouse CD25 （eBioscience， 美国） 抗体，4 ℃下避光孵育30 min，进行表面染色。PBS洗涤2次，加入1 ml 3∶1稀释的破膜固定液（Fixation/Permeabilization， BD， 美国），混匀，4 ℃避光放置1 h；加入2 ml破膜液，离心洗两次，重悬至100 μl，然后加入FITC anti-mouse/rat Foxp3抗体（eBioscience， 美国），混匀，4 ℃下避光孵育1 h，进行核内染色；加入200 μl Flow Cytometry Staining Buffer重悬，用流式细胞仪（BD FACSAriaTM， 美国）分析检测细胞。设空白阴性对照。

1.6.2 CD4+CD25+双阳性T细胞凋亡检测 血标本染色前处理与1.5.1步骤相同。加入PE-Cy5 anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD25抗体后，4 ℃下避光孵育30 min，进行表面染色；然后加入100 μl Binding Buffer和AnexinV-FITC（20 μg/ml， Bender， 美国）10 μl，室温避光30 min后加入200 μl Flow Cytometry Staining Buffer重悬，立即上机进行流式细胞术定量检测，设门圈出CD4+CD25+双阳性T细胞后再对其中AnexinV染色阳性T细胞进行定量分析。

1.7 测定血清细胞因子浓度

采得血液静置15 min，自然凝血后高速离心（3000 r/min，20 min）收集上清液，-70 ℃保存，批量检测。用ELISA试剂盒（Diaclone， 法国）检测血清TNF-α 、IL-2、IL-10和TGF-β的浓度，严格按说明书操作，分别计算出标准曲线和回归方程，将样品吸光度代入标准曲线，计算出样品中细胞因子的蛋白浓度。

1.8 统计学方法

数据录入SPSS 14.0 for Windows进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示；Bartlett方差齐性检验后以单因素方差分析法（方差不齐时用单因素近似F检验法）检验组间差异，并以LSD-t法进行组间两-两比较，Th组和CLP组72 h生存率比较用χ2检验；以P

2 结果

2.1 生存率

所有组别12 h前均无死亡发生；Sham组24 h和72 h亚组各有1只死于腹腔出血，死亡时间均在术后12～24 h；Th组72 h生存率明显高于CLP组（χ2=5.558，P=0.0184）。

2.2 流式细胞检测

2.2.1 Treg占T细胞总数的比例 方差分析显示术后各时间点三组间Treg比例差异均具有统计学意义（P

2.2.2 CD4+CD25+ T细胞凋亡率 术后各时间点凋亡CD4+CD25+ T细胞凋亡率组间比较差异具有统计学意义（P

2.3 血清细胞因子

Sham组4种细胞因子浓度均较另两组低（P

3 讨论

脓毒症的研究涉及感染、炎症、免疫、凝血等一系列基本问题，临床上诸多治疗方法的失败，促使人们对脓毒症本质进行反思[9-10]。Opal等[11]发现特异性免疫功能异常和非特异性炎症反应紊乱是脓毒症最重要的发病机制。机体的免疫功能状态是决定脓毒症结局的重要因素[12]。Treg是一类具有免疫调节作用的T细胞亚群，与脓毒症免疫紊乱密切相关[13-14]，它们可以通过细胞接触机制或细胞因子机制抑制抗原提呈细胞或T细胞活化[15]，导致免疫反应趋向Th2型。Treg抑制免疫反应可减轻炎症损害，但又可导致继发性免疫抑制，调控Treg细胞数量或功能的“恰当”状态以保持炎症免疫反应平衡，是个值得探讨的课题。

本实验脓毒症小鼠Treg比例、CD4+CD25+ T细胞的凋亡率、血清细胞因子水平等指标的显著改变，证实了Treg与脓毒症病程关系密切，同时Tα1干预对上述指标有显著影响，说明Tα1对Treg有调控效应。

文献[16]指出脓毒症启动促炎症反应的同时也启动了抗炎症反应，但作者认为炎症发展的不同阶段二者作用主次不同，早期以炎症反应为主，晚期则以抗炎反应为主或表现为混合抗炎反应。本实验中Treg与抗炎/促炎反应此长彼消的变化和其介导的免疫反应漂移方向有良好的相关性，可以理解为Treg比例增加和凋亡的减少是机体对过度炎症反应的一种自我保护性调节，是诱发脓毒症的细菌、毒素和盲肠的缺血坏死等有害因素的持续刺激，最终导致了Treg的调节失去平衡。

本实验观察到Tα1对Treg比例和细胞因子浓度都产生了“削峰去谷”的效应，脓毒症较早时期（12 h内）炎症反应为主时它降低了IL-2、TNF-α 水平，对与Treg活性密切相关的TGF-β和IL-10也有一定的抑制作用，脓毒症后期则更为显著，说明Tα1能抑制抑炎症因子而相对增加促炎症因子的释放，这符合免疫调理的基本理念。临床试验发现脓毒症死亡患者外周血中CD4+CD25+ T细胞比例明显高于存活者[17]，反证了随着病原体（病灶）的清除、免疫/炎症反应强度的降低，Treg数量和活性有自然回落的趋势。Tα1具有诱导T细胞分化和成熟、抑制效应T细胞凋亡、提高单核细胞的抗原呈递能力、抑制IL-10的产生等药理活

性，是体内正常的生理物质，安全性高，是较为理想的免疫调理剂[18-20]。本实验中动物模型未接受对因或对症治疗，Tα1降低机体免疫/炎症反应强度、减轻免疫抑制程度和提高72 h生存率的结果可靠，提示Tα1有维护脓毒症机体免疫平衡的效应。

Tα1调控炎症反应、促进Treg凋亡，是本实验发现的最为重要的现象。进一步分析发现CLP小鼠Treg比例上升一方面是绝对数的增加，另一方面是效应T细胞大量减少所致，Tα1能有效地抑制Treg的增殖和促进效应T细胞的增殖，CD4+T细胞数得以一定程度的增加。因此可以设想，在脓毒症不同阶段通过选择性Treg增殖或清除进行脓毒症免疫调理，特别是诱导Treg凋亡，可能促使Thl介导的保护性炎症反应恢复，达到既减轻炎症反应性损害又防止出现严重免疫抑制的目的。

Askenasya等[21]证实在自身免疫性疾病中Treg存在主动的活化诱导的细胞死亡（AICD），它是机体维持一定程度的免疫耐受而又避免限入过度的免疫抑制的重要机制。CD25是IL-2R的α链，在Treg上高表达，能够与效应细胞竞争性结合IL-2，使效应细胞无法得到生长信号而不能增殖[22-23]；而Treg对凋亡具有一定的抵抗力，它所分泌的IL-10、TGF-β甚至能诱导CD4+CD25+ T细胞分化为具有Treg活性的T细胞，脓毒症状态下，Treg超常活跃，其特征性细胞分子――Foxp3表达也显著增强[21]。本实验表明Tα1对Treg的免疫效应不强化脓毒症早期的炎症反应；脓毒症后期IL-2、TNF-α 保持相对较高的水平，说明Tα1能增强效应T细胞功能，减轻Treg介导的免疫抑制，其主要机制可能是诱导Treg凋亡。

免疫调理在治疗脓毒症的临床研究中获得了意想不到的效果[24-25]，本实验观察到Tα1具有平衡炎症反应、诱导Treg凋亡的免疫调理效应，提高了动物模型生存率，意义重大，但其中确切机制仍有待更深入的研究。

参考文献

[1]Dellinger RP， Levy MM， Carlet JM，et al.Surviving sepsis campaign： international guidelines for management of severe sepsis and septic shock：2008[J].Intensive Care Med，2008， 34（1）：17-60.

[2] Carlos FAC.Global perspectives of antibiotic resistance[R]. Antimicrobial resistance in developing countries. 2010：3-13.

[3] Alexander M，Frank JS. The burden of sepsis-associated mortality in the United States from 1999 to 2005： an analysis of multiple-cause-of-death data[J].Crit Care，2009，13（1）：R28.

[4] Antonopoulou A， Giamarellos-Bourboulis EJ. Immunomodulation in sepsis： state of the art and future perspective[J]. Immunotherapy， 2011，3（1）：117-128.

[5] Allan LG， Adam LG. From lab to bedside： emerging clinical applications of thymosin α1[J]. Expert Opin Bio Ther，2009，9（5）： 593-608.

[6] Romani L，Bistoni F，Montagnoli C，et al. Thymosin α1：an endogenous regulator of inflammation， immunity， and tolerance[J]. AnnNew York Acad Sci，2007，1112（9）：326-338.

[7] Kessel A，Bamberger E，Masalha M，et al. The role of T regulatory cells in human sepsis[J]. J Autoimmun，2009，32（3/4）：211-215.

[8] 姚咏明.关注调节性T细胞在脓毒症中的免疫学意义[J].中华急诊医学杂志，2009，18（2） ：117-119.

[9] Minnich DJ， Moldawer L. Anti-cytokine and anti-inflammatory therapies for the treatment of severe sepsis： progress and pitfalls[J]. Proc Nutr Soci，2004， 63（3）：437-441.

[10]Clayton JK，Starr JA.Novel approaches to the treatment of sepsis syndrome[J].J Pharm Pract Oct，2008，21（5）：371-379.

[11] Opal SM.The host response to endotoxin， antilipopolysaccharide strategies， and the management of severe sepsis[J].Intern J Med Mic，2007，297（5）：365-377.

[12] Venet F， Lepape A， Monneret G. Monitoring immune dysfunction in septic patients： toward tailored immunotherapy[J].Inten Care Med，2009， Ⅱ：81-90.

[13] 张剑，唐朝晖.CD4+CD25+调节性T细胞在严重创伤、脓毒症后免疫抑制中的作用机制[J].中华急诊医学杂志，2011，20（1）： 102-103.

[14] Sakaguchi S， Yamaguchi T， Nomura T， et al. Regulatory T cells and immune tolerance[J]. Cell，2008， 133 （5）：775-787.

[15] Askenasy N， Kaminitz A， Yarkoni S. Mechanisms of T regulatory cell function[J]. Autoimmun Rev，2008，8（7）：370-375.

[16]Osuchowski MF， Welch K， Siddiqui J， et al. Circulating cytokine/inhibitor profiles reshape the understanding of the SIRS/CARS continuum in sepsis and predict mortality[J]. J Immunol，2006， 177（3）：1967-1974.

[17] Monneret G，Debard AL，Venet F，et a1.Marked elevation of human circulating CD4+CD25+ regulatory T cells in sepsis-induced immunoparalysis[J]. Crit Care Med，2003， 31（7）：2068-2071.

[18] Romani L，Bistoni F，Perruccio K. Thymosin α1 activates dendritic cell tryptophan catabolism and establishes a regulatory environment for balance of inflammation and tolerance[J]. Blood，2006，108（7）：2265-2274.

[19] Yao WY， Zhu Q，Yuan YZ.Thymosin alpha 1 improves severe acute pancreatitis in rats via regulation of peripheral T cell number and cytokine serum level[J].J Gast Hepat，2007，22（11）：1866-1871.

[20] Kapoor S. The rapidly expanding therapeutic role of thymosin {alpha}-1 in the management of gastrointestinal and systemic infectious disorders[J]. J Inten Care Med，2009，24（3）： 210-211.

[21]Askenasya N，Kaminitza A，Yarkoni S.Mechanisms of T regulatory cell function[J].Autoimmun Rev， 2008，7（5）：370-375.

[22] Yolcu ES，Ash S，Kaminitz A. Apoptosis as a mechanism of T-regulatory cell homeostasis and suppression apoptosis in T-regulatory cell homeostasis[J].Immun & Cell Biology，2008，86（8）：650-658.

[23] 冷凤英，刘嘉林，瞿洪平. 脓毒症患者自然调节性T细胞及可溶性CD25水平研究[J].中华急诊医学杂志，2011，20（2）：184-188.

[24] Hotchkiss RS， Opal S. Immunotherapy for sepsis ― a new approach against an ancient foe[J]. N Engl J Med，2010， 363（1）：87-89.

[25]厉惠莉，章华权. 胸腺肽 α1 联合阿德福韦酯治疗甲胎蛋白升高的慢性乙型肝炎临床观察[J/ CD]. 中华危重症医学杂志：电子版，2010，3（4）：259-262.

[26]Huang SW，Guan XD，Chen J，et al. Effect of ulinastatin plus thymosin-α1 therapy on improving immune function in septic patients[J]. Chin J Pathophy， 2009，25（11）：2168-2172.

（收稿日期：2012-11-13）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.04.007

基金项目：上海市公共卫生优秀学科带头人培养计划（08GWD21）

作者单位：201100 上海，闵行区中心医院急诊&ICU（万健、邓星奇）；第二军医大学上海长征医院急救科（单怡、林兆奋、单红卫、杨兴易）

通信作者：林兆奋，Email：

P368-P372