大鼠口服芍苓消银片后血液中芍药苷?落新妇苷?迷迭香酸?异嗪皮啶?甘草苷的药物动力学研究

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[摘要] 芍药苷?落新妇苷?迷迭香酸?异嗪皮啶和甘草苷为芍苓消银片中主要成分，为给其后期剂型及临床用药方案设计奠定基础，该文建立了这5种成分血药浓度含量测定方法并进行大鼠体内药物动力学的研究?血药浓度测定采用HPLC测定，菲罗门C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），甲醇-乙腈-0.05%甲酸梯度洗脱，流速0.8 mL・min-1，检测波长275 nm?样品处理采用固相萃取法?大鼠灌胃芍苓消银片浸膏后分别于不同时间采血，测定血药浓度?实验结果显示5种成分可基线分离，芍药苷?异嗪皮啶?落新妇苷?迷迭香酸和甘草苷分别在2.48～248， 0.213 6～21.36， 0.531～53.1，0.704～70.4，0.253～25.3 mg・L-1线形关系良好?5种成分均可吸收入血，均为快速吸收?快速消除的模式?该文建立的方法快速?准确，可用于含同类成分的制剂的体内分析，芍苓消银片中主要成分吸收消除较快，适合制备成缓控释制剂，普通制剂可能需要1 d服药4～6次?

[关键词] 芍药苷；异嗪皮啶；落新妇苷；迷迭香酸；甘草苷；芍苓消银片；药物动力学

[收稿日期] 2014-01-13

[基金项目] 广东省自然科学基金项目（S2013030011515）；广东省科技厅-广东省中医院联合专项项目（2011B032200009）；广东省中医院项目（YK2013B1N11）

[通信作者] 卢传坚，E-mail：

芍苓消银片（银屑灵优化方）为正在开发中的新药，由赤芍，土茯苓，肿节风，甘草等药物组成，具有活血化瘀?养血活血?化瘀通络的功效，主要用于治疗血瘀型寻常性银屑病?芍药苷?落新妇苷?迷迭香酸?异嗪皮啶?甘草苷是方中赤芍?土茯苓?肿节风?甘草中的主要成分?为考察其是否可吸收入血发挥临床治疗作用，药物动力学特征适用于何种剂型，笔者建立了这5种成分体内分析方法，进行了大鼠体内的药物动力学研究?

1 材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相VWD检测器（美国安捷伦公司）；超低温冰箱（NEW BRUNSWICK英国）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；IKA涡旋震荡仪 （型号GENIUS3，德国）；白洋台式离心机（G20河北省安新县白洋离心机厂）；Waters20管型固相萃取仪（美国Waters公司）；Waters HLB固相萃取小柱（规格1cc/30 mg，美国Waters公司）；Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；ACURA 825移液枪（瑞士）?

1.2 试药

所有原药材均来自康美药业股份有限公司，芍苓消银片提取物由本实验室自制，芍苓消银浸膏相当于生药4.20 g・mL-1，浸膏中芍药苷?异嗪皮啶?甘草苷?落新妇苷?迷迭香酸含量分别为1.18， 0.56，1.87，5.05， 0.14 g・L-1?芍药苷?异嗪皮啶?甘草苷对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-200934，110837-200304，111610-200604；落新妇苷?迷迭香酸对照品购自上海源叶生物科技有限公司，批号分别为20100318， 20100526；甲醇（色谱纯，批号333042，天津四友）；乙腈（色谱纯，批号90139，迪马公司）；甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）?

1.3 动物

健康雄性SD 大鼠，SPF级，体重（320±40） g，广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号（粤）2008-1951，并通过实验动物伦理委员会审查?

2 方法

2.1 色谱条件

Phenomenex C18柱；流动相B甲醇，C乙腈，D 0.05%甲酸，梯度洗脱条件：0～5 min，B-C-D（20∶5∶75）～B-C-D（30∶5∶65）；5～10 min，B-C-D（30∶5∶65）～B-C-D（35∶10∶55）；10～20 min， B-C-D（35∶10∶55）～B-C-D（40∶10∶50）；流速0.8 mL・min-1；检测波长275 nm， 进样量10 μL?

2.2 血浆样品的处理

取血浆样品200 μL，加入等量的双蒸水，涡旋混匀，上样于活化后的SPE小柱，用1 mL双蒸水洗涤，弃去，最后用1 mL 0.1%甲酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；置于waters固相萃取仪中用空气气流吹干，残渣用200 μL 70%甲醇复溶，12 000 r・min-1离心3 min后，取上清液，进样10 μL分析?

2.3 对照品溶液的制备

取适量芍药苷，异嗪皮啶，甘草苷，落新妇苷，迷迭香酸对照品，精密称定，加70%甲醇配制成含芍药苷（745 mg・L-1），异嗪皮啶（534 mg・L-1），甘草苷（506 mg・L-1），落新妇苷（531 mg・L-1），迷迭香酸（704 mg・L-1）的混合对照品70%甲醇储备液?

2.4 标准曲线的建立及最低检测线和最低定量限确定

取混合对照品储备液和空白血浆配制成含芍药苷（298 mg・L-1），异嗪皮啶（21.36 mg・L-1），甘草苷（25.3 mg・L-1），落新妇苷（53.1 mg・L-1），迷迭香酸（70.4 mg・L-1）的血浆储备液，采用稀释法配制一系列标准曲线浓度?各成分标准曲线各质量浓度分别为芍药苷（298，149，59.6，29.8，14.9，5.96，2.98 mg・L-1）；异嗪皮啶（21.36，10.68，4.272，2.136，1.068，0.427 2，0.213 6 mg・L-1）；甘草苷（25.3， 12.65， 5.06， 2.53， 1.265， 0.506，0.253 mg・L-1）；落新妇苷（53.1，26.6，10.6，5.31，2.66，1.06，0.531 mg・L-1）；迷迭香酸（70.4，35.2，14.08，7.04，3.52， 1.408，0.704 mg・L-1）?用2.2项所述方法处理样品?以被测化合物的峰面积（Y）对其在血浆中的浓度（X）进行线性回归得各成分的标准曲线及线性范围，得各成分的标准曲线?以信噪比S/N=7确定最低检测线（LOD），以标准曲线的下线确定最低定量限（LOQ）?

2.5 准确度和精密度

测定高?中?低3个质量浓度的质控样品（含芍药苷149，29.8，5.96 mg・L-1；异嗪皮啶10.68，2.136，0.427 2 mg・L-1；甘草苷12.65，2.53，0.506 mg・L-1；落新妇苷26.6，5.31，1.06 mg・L-1；迷迭香酸35.2，7.04，1.408 mg・L-1）的对照品浓度，与加入量进行比较，计算准确度； 对照品同一样品在1 d内不同时间进样测定，考察日内精密度；同一样品在不同日期内进样，考察日间精密度?

2.6 绝对回收率

制备高?中?低3个浓度的质量控制样品（n=5）?另取高?中?低3个浓度的对照品溶液，同法测定?将质量控制样品的峰面积与未经提取处理的相应浓度的对照品的峰面积比较，计算绝对回收率?

2.7 稳定性

在本实验条件下，取低?中?高3个浓度的质量控制样品，在室温下24 h及4 ℃冰箱放置48 h，测定；3个浓度质控样品经3次冷冻-融解循环（-80 ℃），处理后进样测定?

2.8 药物动力学试验

将大鼠6只，实验前禁食12 h，不禁水，灌胃给予芍苓消银片浸膏，灌胃量为12 μL・g-1?10%水合氯醛按30 μL・g-1麻醉，于5，15，30，60 min，2，4，6，8 h眼眶采血0.5 mL，血样0.5 h内处理，全血12 000 r・min-1离心3 min，取血清，置-80 ℃冰箱保存至分析?

2.9 数据处理

用DAS 2.1药代动力学程序软件处理血药浓度数据?用非隔室模型估算药代动力学参数，数据以±s表示（n=6）?

3 结果

3.1 分析方法的方法学考察

3.1.1 专属性试验 空白血浆，混合对照品加空白血浆，大鼠灌胃芍苓消银片2 h时间点的色谱图，见图1?5种成分可达到基线分离，无杂质峰干扰?

3.1.2 线性关系 芍药苷?异嗪皮啶?甘草苷?迷迭香酸?甘草酸的标准曲线?线性范围?最低检测线最低定量限结果见表1，5种成分在线性范围内呈现良好的线性关系?

3.1.3 绝对回收率试验 结果见表2，绝对回收率在69.44%～89.13%，可满足分析需要?

3.1.4 精密度?准确度考察 结果见表3，准确度及精密度数据在87.9%～118.6%，日内RSD

3.1.5 稳定性结果 样品经反复冻融，测定结果见表4，样品储存于4 ℃ 24 h内测定RSD

3.2 大鼠灌胃芍苓消银片后5种成分的药物动力学结果

大鼠灌胃给予芍苓消银片浸膏后5种成分的血药浓度-时间曲线图见图2，以用DAS 2.1药代动力学程序软件处理血药浓度数据，见表5?

由图2和表5可以看出，所测的5种成分均可吸收入血，药物吸收迅速，在1 h附近即可达峰，除芍药苷外，其他成分基本在2 h内可基本消除，提示消除也很迅速?

4 讨论

药物体内行为与其剂量有关，为了更好的与药效实验结果配合，本研究中的剂量采用药效研究中的有效剂量即相当于临床等效剂量的4倍剂量?

由于药物在靶部位的浓度决定疗效，所以药物能否起效首先取决于其是否能够吸收?银屑病的病变部位在皮肤，药物在血液中的浓度可反映其到达病变部位的浓度?本研究显示处方中芍药苷?落新妇苷?迷迭香酸?甘草苷和异嗪皮啶均可被吸收，有可能是芍苓消银片的有效成分?以芍药苷为主要成分的白芍总苷有临床用于治疗银屑病的报道，提示其具有治疗银屑病的作用[1-2]；迷迭香酸具有免疫调节?抗炎等作用[3]?落新妇苷?甘草苷?异嗪皮啶则少见药理研究的报道，这些成分是否是芍苓消银片的有效成分还有待进一步证实?

尽管本文所测的5种成分结构?性质各不相同，但其体内过程却惊人的相似，提示芍苓消银片中主要成分可能都是吸收迅速伴消除迅速的模式，因此，普通制剂可能需要每日4～6次给药才能维持正常的血药浓度；该药物应该考虑开发成缓释制剂以提高生物利用度，减少服药次数，增加患者依从性?

[参考文献]

[1] 焦晓燕，郭在培，陈涛，等. 白芍总苷对轻中度寻常型银屑病患者氧化应激状态的影响[J] . 中国皮肤性病杂志，2012，26（4）：287.

[2] 杜宇，廖勇梅，杨西群，等. 白芍总苷对寻常型银屑病患者血清瘦素和IL-18水平的影响[J]. 重庆医学，2012，41（6）：567.

[3] 苏平，王根女，吴丹，等. 迷迭香酸的生理活性?功能及其来源研究进展[J] . 食品与发酵工业，2008，34（12）：135.

Pharmacokinetic study on peoniflorin， astilbin， rasmarinci acid，

isofraxidin and liquiritin in rat blood after oral administration of

Shaolin Xiaoyin tablets

ZHAO Rui-zhi， WANG Yin-jie， FENG Li-min， LU Chuan-jian

（Second Clinical College， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510120， China）

[Abstract] To establish a method for the determination of astilbin， peoniflorin， rasmarinci acid， isofraxidin and liquiritin contained in Shaolin Xiaoyin tablets， in order to lay a foundation for designing late-stage dosage forms and clinical medication schemes. In this paper， efforts were made to establish a method for the determination of the blood concentration of the five components and study the in vivo pharmacokinetics in rats. The blood concentration was determined by HPLC. Phenomenex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted and eluted with methanol-acetonitrile-0.05% formic acid， the flow rate was 0.8 mL・min-1， and the wavelength was 275 nm. The samples were processed by the solid phase extraction method. After oral administration of Shaoling Xiaoyin tablets， the rat bloods were collected at different time points to determine the blood concentrations. The experimental results showed that the baseline separation could be adopted for the five components， and astilbin， peoniflorin， rasmarinci acid， isofraxidin and liquiritin showed good linear relations within ranges of 2.48-248， 0.213 6-21.36， 0.531-53.1，0.704-70.4， 0.253-25.3 mg・L-1. All the five components could be absorbed in blood and excreted quickly. The method established in this paper is rapid and accurate， and could be used for in vivo analysis on preparations containing similar components. The main components in Shaoling Xiaoyin tablets could be absorbed and excreted quickly， and thus suitable to be made into sustained release tablets. Common preparations are required to be taken for 4-6 times a day.

[Key words] peoniflorin； isofraxidin； astilbin； rosmarinci acid； liquiritin； Shaoling Xiaoyin tablets； pharmacokinetics

doi：10.4268/cjcmm20141339