重组Lv―SWD蛋白的表达、纯化与细菌结合试验

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摘要：通过重组lv-swd蛋白的表达与纯化，进行多克隆抗体的制备与细菌结合试验，研究凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）重组SWD蛋白在先天免疫系统中的功能。结果表明，Lv-SWD的预测分子质量为12.9 ku，实际大小与理论值相符合。重组Lv-SWD蛋白作为抗原制备的多克隆抗体，可以较好地识别蛋白质本身，且可以直接结合巨大芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）以及弧菌（Vibrio）4种细菌。

关键词：凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）；SWD抗菌肽；多克隆抗体制备；细菌结合试验

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1189-02

目前，对于抗菌肽分子在先天免疫系统中发挥作用的机理还不是十分清楚，根据目前的研究结果来看，抗菌肽分子在发挥抑菌功能的过程中主要存在两种模式，一种是直接与细菌作用将其瓦解，另一种是发挥蛋白酶活性抑制剂作用来将细菌除掉[1]。本研究以凡纳对虾（Litopenaeus vannamei）重组Lv-SWD蛋白作为研究对象，通过蛋白质表达纯化以及多克隆抗体的制备，利用细菌结合试验来研究Lv-SWD的细菌结合作用，进一步丰富无脊椎动物先天免疫系统关于抗菌肽的基本理论。

1 材料与方法

1.1 材料

表达菌株是含有pET-28a-Lv-SWD重组子的大肠杆菌表达菌株。细菌结合试验的目标菌株分别是2种革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、巨大芽孢杆菌Bacillus subtilis）和2种革兰氏阴性细菌（绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和弧菌Vibrio）。制备多克隆抗体需要的家兔为包头市花苑小动物市场购买的普通长耳白兔。

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的表达纯化 对构建的重组Lv-SWD蛋白的重组表达菌株进行IPTG诱导表达，离心收集菌体进行超声波破碎，并且通过蛋白质电泳试验分析破碎后的上清液与包涵体沉淀中目的蛋白质的存在情况。对于存在于破碎后上清液中的目的蛋白质，可以直接利用His-tag镍柱进行亲和纯化；对于存在于包涵体中的目的蛋白质，要进行变性后的透析处理，才能进行亲和纯化[2]。

1.2.2 多克隆抗体的制备与检测 将亲和纯化后的目的重组蛋白质进行SDS-PAGE试验，检测蛋白质的纯度，利用Bradford法检测目的重组蛋白的浓度；之后将目的蛋白质作为抗原免疫家兔，进行多克隆抗体的制备；家兔免疫共需要4～5次，每次注射间隔7～10 d，并且按照皮下多点注射的原则每次至少注射200 ？滋g重组蛋白。首次免疫将蛋白质抗原与弗氏完全佐剂按1∶1（V∶V，下同）进行充分混合后注射，第二、第三次注射与弗氏不完全佐剂进行充分混合后注射，从第四次免疫开始直接注射蛋白质溶液[3]。利用Western Blot方法进行多克隆抗体的检测。

1.2.3 重组蛋白质的细菌结合试验 将进行细菌结合试验的目的细菌菌株进行过夜培养，第二天低速离心收集细菌菌体，用500 ？滋L 1×PBS缓冲液悬起，加入经过1×PBS缓冲液透析的500 ？滋L目的蛋白质溶液（1 mg/mL），室温条件下摇床孵育1 h；低速离心后用500 ？滋L 1×PBS缓冲液洗涤5次。之后用7% SDS溶液200 ？滋L孵育菌体，沉淀10 min，离心后收集最后的菌体沉淀和7%的SDS洗脱液。将第五次的1×PBS洗脱液、7%的SDS洗脱液、最后的菌体沉淀作为样品进行SDS-PAGE，转膜后利用Western Blot方法检测结合试验的效果，使用的抗体是重组Lv-SWD蛋白制备的多克隆抗体[4]。

2 结果与分析

2.1 重组Lv-SWD蛋白的纯化与多克隆抗体的检测结果

大肠杆菌表达菌株经过IPTG诱导能够正确表达重组Lv-SWD蛋白，理论分子量为12.9 ku，由图1可见，纯化后蛋白条带的大小接近14.3 ku，说明重组蛋白的大小与理论预测值相符。Western Blot分析结果（图1）表明，重组Lv-SWD蛋白刺激家兔产生的多克隆抗体能够较好的识别蛋白质本身。

2.2 细菌结合试验结果

细菌结合试验结果（图2）表明，利用重组Lv-SWD蛋白制备的多克隆抗体识别醋酸纤维素薄膜后，4种细菌的菌体沉淀处都有明显的条带出现，说明巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及弧菌都能较好的结合重组Lv-SWD蛋白。

3 小结与讨论

目前，对于抗菌肽分子的研究比较深入，尤其是在甲壳类动物中的研究成果较多。在中国明对虾、淡水小龙虾、克氏原鳌虾、南美白对虾、斑节对虾等动物中分别发现了甲壳肽、溶菌酶、抗脂多糖因子、对虾素等免疫效应分子[5]，这些分子多数具有一定的先天免疫相关功能，包括抗菌活性、结合细菌活性、蛋白酶活性抑制作用等。通过研究这些分子的结构特征发现，一般情况下无脊椎动物先天免疫相关的抗菌肽分子具有广泛的多样性，包括结构多样性与功能多样性[6]。在结构方面，抗菌肽分子一般都包括一个典型的结构域，例如WAP结构域、对虾素结构域、溶菌酶结构域，这些结构域的最重要特点就是具有成对出现的半胱氨酸残基，数目一般在8个以上[7]。

为了进一步研究抗菌肽分子的结构与功能之间的联系，本研究选择了凡纳对虾的SWD分子进行了系统研究。凡纳对虾的SWD分子中存在一个单独的WAP结构域，这个结构域主要由8个半胱氨酸残基组成。通过结构预测发现，这8个半胱氨酸残基可以形成4对二硫键，本研究在整个分子中形成一个球状的实体结构和一个疏水的空穴。通过大肠杆菌原核表达，利用重组蛋白作为抗原，制备了多克隆抗体。从而对分子的细菌结合功能进行了研究，结合此前进行的蛋白酶活性抑制试验，笔者发现重组的Lv-SWD蛋白具有抑制分泌型蛋白酶活性的作用，也存在直接结合细菌的功能，因此，推测在先天免疫系统中，Lv-SWD蛋白是一个重要的免疫效应分子，在对抗细菌的入侵过程中应该发挥着重要的功能。

参考文献：

[1] DU Z Q，REN Q，ZHAO X F，et al.A double WAP domain （DWD）-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B： Biochemistry and Molecular Biology，2009，154（2）：203-210.

[2] DU Z Q，LI X C，WANG Z H，et al.A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkii[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C，DU X J， XU W T，et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology，2010， 28（4）：517-524.

[4] LI X C，DU Z Q，LAN J F，et al. A novel pathogen-binding gC1qR homolog， FcgC1qR， in the Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（2）：400-407.

[5] KRUSONG K， POOLPIPAT P， SUPUNGUL P， et al. A comparative study of antimicrobial properties of crustinPm1 and crustinPm7 from the black tiger shrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol，2012，36（1）：208-215.

[6] MU C，ZHENG P，ZHAO J，et al. A novel type III crustin （CrusEs2）identified from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J].Fish Shellfish Immunol，2011，31（1）：142-147.

[7] SMITH V J. Phylogeny of whey acidic protein（WAP）four-disulfide core proteins and their role in lower vertebrates and invertebrates[J]. Biochem Soc Trans，2011，39（5）：1403-1408.