血塞通注射液对肢体缺血―再灌注损伤一氧化氮及一氧化氮合酶的影响

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【摘要】目的 探讨血塞通注射液对肢体缺血―再灌注损伤一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)的影响。方法 健康SD大鼠56只,其中,空白组8只,其余随机分为对照组和实验组,每组又均分缺血1小时组和缺血2小时组,建立后肢缺血―再灌注损伤模型。建立模型前,实验组大鼠腹主动脉注射血塞通注射液,对照组注射等量生理盐水。在缺血前,缺血1小时,缺血2小时,再灌注后2小时,再灌注后4小时各自从腹主动脉采血,分离血清,测定血清NO,NOS,的含量;结果 两组血清NO含量在缺血1小时和2小时后比缺血前均明显增高(P均

【关键词】一氧化氮;一氧化氮合酶;血塞通注射液;缺血―再灌注损伤;肢体

【Abstract】Objective To investigate the effect of Xue sai tong injection on nitric oxide(NO)and nitric oxide synthase(NOS)in rats with extremity ischemia/reperfusion injury. Methods The experimental models of extremity ischemia/reperfusion injury were established in 48 SD rats that were random divided into control group and experimental group,every group were random divided into one-hour group and two-hour group,theother 8 rats was Non-treatment group .Before the models were established,Xue sa itong was infused into rats of the experimental group and normal saline infusiond into control group.Before ischemia,1 hour after ischemia,2 hours after ischemia,2 hours after reperfusion and 4 hours after reperfusion,the samples of blood were taken from aorta respectively for measurement of NO and NOS inserum. Results The NO levels of serum in ischemia 1 hour and 2 hours were significantly higher than that before ischemia (P

近年来,有关缺血―再灌注损伤的发生机制与药物保护作用的研究,国内外有很多相关文献报道,主要集中在心、脑、肺、肝和肾等方面,对于肢体缺血―再灌注损伤的报道,以及对中药干预的研究相对比较少。所以,我们设计了这个实验,旨在观察血塞通注射液对肢体缺血―再灌注损伤时一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料血塞通注射液为云南植物药业有限公司生产,每支10ml,批号:Z53020134。实验动物为健康SD大鼠48只,体重200g～220g,随机分为对照组和实验组,每组又各自分为缺血1h组和缺血2h组,每组12只。

1.2 动物模型制备建立大鼠后肢缺血―再灌注损伤模型。动物术前禁食12h,10%水合氯醛1ml/100g经腹腔注射麻醉,胸骨正中下方0.5cm处剪毛,常规消毒,铺无菌洞巾,做纵切口,切开皮肤和皮下组织,游离出腹主动脉,用微血管夹夹闭。按照分组,分别于缺血1h,2h后,去除血管夹,恢复血流灌注。以上各组分别于建立模型前分别按实验组和对照组将1ml血塞通和1ml生理盐水注射于大鼠腹腔。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 标本采集实验组和对照组的缺血1小时组在缺血前,缺血1小时,再灌注2小时,再灌注4小时从腹主动脉采血1ml,缺血2小时组在缺血前,缺血2小时,再灌注2小时和4小时从腹主动脉采血1ml。血液凝固后以1500r/min离心10分钟,留取血清,零下100℃冷冻待检。

1.3.2 NO和NOS检测用硝酸还原酶法测定NO含量,用分光光度法测定NOS活性。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,测定步骤按说明书。

1.3.3 统计学处理实验数据用均数加减标准差表示( ±s)。用Levene 法进行方差齐性检验,若方差齐,用单因素方差分析,组间及组内比较采用LSD法检验; 若方差不齐,则用Games-Howell法进行分析。

2 结 果

2.1 血清NO含量变化见(表1,表2):缺血后1h和2h组血清NO含量均比缺血前有较明显的增高(P均

2.2 血清NOS活性变化见(表1,表2):缺血后血清NOS活性比缺血前均降低(P均

注: 与本组缺血前比较: P< 0.05,P

3 讨 论

3.1 NO和NOS在肢体缺血―再灌注损伤中的作用:目前对骨骼肌缺血―再灌注后一氧化氮(NO)分泌量的动态变化及NO在骨骼肌缺血―再灌注中的作用尚不十分明了,有研究认为,NO作为自由基可加重骨骼肌缺血再灌注损伤[1,2];另有研究表明,内皮源性舒张因子即NO 释放减少是导致缺血―再灌注损伤的重要因素[3]。血管内皮细胞中的左旋精氨酸(L-Arg) 在NOS的催化下合成NO,可以在体内经过一连串复杂的生理、生化过程来松弛血管平滑肌,调节血管的基本张力,调整局部组织血流分布[4],抑制血小板聚集、粘附,保护细胞;在病理生理状态下未过量表达的情况下NO可能具有一定的保护作用[5]如过量表达,产生过量的NO亦有强烈的毒性作用[5]。高浓度的NO将导致细胞和组织损伤[6]。

本实验发现,缺血后,大鼠血清中NO的含量迅速升高,再灌注后2h后显著升高,再灌注4小时后回落,该结果与孙宇一等人[7]研究结果相似,说明再灌注后会有大量NO形成,对骨骼肌产生一定的损伤,其机制可能和TNF-a诱导的具有iNOS的细胞产生NO有关。药物实验组NO浓度较对照组低,说明血塞通注射液对缺血再灌注肢体损伤有保护作用。在试验中有一情况,即在缺血再灌注之后NO含量降低,NOS活性反而增加,经考虑,这可能是因为再灌注的过程中,刺激产生了过量超氧阴离子,与再灌注后产生的大量NO 发生反应,生成了强氧化剂超氧亚硝酸根离子(ONOO-) ,正是由于更具毒性的ONOO -导致并加重再灌注损伤作用。所以我们有理由认为,NO增加是造成骨骼肌缺血再灌注损伤加重的重要因素之一。

本实验同时发现,缺血后NOS活性明显降低,NO含量却显著增加,可能是由于缺血后组织NOS的合成受到抑制,NO的增加可能是因为血流停滞后NO积聚所造成,也可能受各种细胞因子及炎症介质的诱导而催化L-精氨酸生成大量的NO分子。有研究证明,肢体缺血―再灌注后骨骼肌组织内诱导型一氧化氮合酶( i NO S)含量增加[8-9]。哺乳动物细胞内至少有3种基因来编码不同的NOS异型,有内皮型一氧化氮合酶,神经型NOS,诱导型一氧化氮合成酶iNOS,前两者基因本身存在于细胞内又叫结构型NOS(cNOS)。cNOS生成的NO有舒张血管、抑制血栓等功能,对组织有一定的保护作用;iNOS不存在于休眠状态的细胞中,当细胞受到某些因素活化时经基因转录蛋白合成而产生,由此产生的过量NO 及其毒性产物可导致组织的严重损伤。随着NO特异性抑制剂的不断开发,对NO途径进行干预已成为可能,应用选择性i NOS抑制剂如氨基胍(AG)、 L-Arg 等可减轻组织的损伤[10]。血塞通注射液可能对缺血再灌注后损伤的肢体cNOS和iNOS的表达具有不同的调节作用。应用血塞通注射液后NOS升高而NO未显著升高,表明此注射液在 iNOS催化形成NO的一些环节发挥着调节作用。

3.2血塞通注射液在肢体缺血―再灌注损伤中所起的作用目前对肢体缺血―再灌注损伤依然没有有效的药物治疗,对超氧化物歧化酶(SOD)、 甘露醇、 山莨菪碱以及中药丹参等研究得较多,发现这些药物能不同程度地减轻骨骼肌的损伤[11-14] 。血塞通注射液主要成分为三七总皂甙,其成份具有止血,抗血栓形成,扩血管,降压抗炎,保护心脑神经系统等作用[15],主要应用于心脑血管及周围血管疾病的治疗。 近来,有学者对血塞通注射液在心肌缺血―再灌注损伤的防治方面做了研究[16] 。表明其用药安全而不良反应较少,常规用药途径,使用方便。我们的实验结果可以说明,血塞通注射液可以降低肢体缺血―再灌注损伤时的NO 水平,同时增加NO S 活性,进而减轻肢体缺血―再灌注损伤,对其具有比较显著的保护作用。

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