不同抗原修复液和固定时间对免疫组化结果的影响

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【摘要】 目的 针对不同的抗原修复液与时间对免疫组化所产生的影响进行探讨。方法 取出26例乳腺浸润性导管癌标本试样。其中的每例中附着4个时间点，这四个时间点组分别为：立即固定组，延迟12小时固定组，延迟24小时固定组和延迟48小时固定组。依次对所选取4块肿瘤组织，在肿块部位进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋和切片等相关操作，利用行HE染色方法验证试验中的肿瘤组织，再通过抗原修复液展开免疫组化验证实验。结果 CK7、ER和C-erbB-2在4组试样在不等的时间和不同的抗原修复液的乳癌组织间表现出了不同的效果，并且结果的差异可以从统计学角度进行分析。结论 在本实验中，所进行延迟固定的组织，在通过充分固定和进行选取抗原修复液A[高温高压EDTA（pH9.0）缓冲液修复）]、抗原修复液B[高温高压EDTA（pH8.0）缓冲液修复]、抗原修复液C[高温高压柠檬酸盐（pH6.0）缓冲液修复]和抗原修复液D[微波炉EDTA（pH9.0）缓冲液修复法]的前提下能够进行免疫组化检测，但需要注意的是尽量减少和避免延迟固定时间。

【关键词】 抗原修复液；固定时间；免疫组化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章编号：1004-7484（2012）-08-2487-02

随着医学技术和相关领域的不断发展，免疫组织化学技术作为一门新兴的学科出现了。它是一门基于免疫和分子生物学与病理形态学等学科综合的技术，主要是通过已知抗体或抗原进行对实验中的组织细胞中探测的抗原或抗体检测。典型特征包括操作易于实现，准确性高和特异性强，并且能够将形态和机能相互整合。该种技术已在实际中能够进行病理和鉴别诊断，组织胚胎和神经解剖等相关领域的实验研究[1]。通常情况下，只有在正确及时的固定离体组织前提下，免疫组化技术才能得出精确度高的实验结果。但是，由于实际操作中存在大量的影响因素造成不能正确及时的固定离体组织，特别是在进行尸检标本时，对实验的要求更高。本文的研究重点就是考察这些组织是否能够做免疫组化实验，对于不同抗原修复液和固定时间对免疫组化结果的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 采集本院在2008年1月至2009年12月手术中送检，并且确诊为乳腺浸润性导管癌的26例标本。在实验中，每一标本中选取4块肿块部位，其中的四个时间点分别是：t1，t2，t3和t4。t1，t2，t3和t4分别代表立即固定组，延迟12小时固定组，延迟24小时固定组，延迟48小时固定组。将其中的1块标本马上置于10%的中尔马林液中进行固定，并将实验中的其余3块分别于延迟12、24、48小时后放入10%中尔马林液进行固定。然后对于以上标本固定满24小时后进行脱水、透明、浸蜡和包埋相关操作，再进行切片行HE染色验证肿瘤组织。并且将染色结果为阴性者立即固定组免疫组化，同时不再做与其相应延迟固定组的标本标记染色。

1.2 试剂与方法 采用的试剂包括：鼠抗人CK7单抗，抗人C-erbB-2，单抗兔抗人ER单抗和鼠及ElivisionTM plus（即用型检测试剂盒和DAB试剂盒均购于福建迈新生物技术开发有限公司）。采用两步法进行免疫组化，即分别用柠檬酸高压热修复和胃酶修复，并且严格按照ElivisionTM plus试剂盒要求的操作步骤进行操作。其中，脱水透明，中性树胶封片，DAB显色和苏木素轻度复染，并且用PBS进行替换一抗作为阴性对照。其中，不同抗原修复液分组：pH为9.0的高温高压EDTA缓冲液修复（A），pH为8.0高温高压EDTA缓冲液修复（B），pH为6.0高温高压柠檬酸盐缓冲液修复（C），pH为9.0微波炉EDTA缓冲液修复（D），pH为8.0微波炉EDTA缓冲液修复（E），pH为6.0微波炉柠檬酸盐修复法（F）。

1.3 结果判定 进行阳性定位在细胞浆和阳性定位在细胞核的免疫组化切片，将其中具有特征代表的10个在400倍视野中观察，对其中的阳性细胞占整体细胞的比例进行计数如下：计阳性细胞数占整体细胞比例在25%以下记做（±），占整体细胞比例在25%-50%记做（+），占整体细胞比例在50%-75%记为（++），占整体细胞比例在75%以上记为（+++），并且相应的评价分为1，2，3，4分；同样的，以（±），（+），（++）表示染色强度，并且相应的评价分为1，2，3分。最后，将两种记分乘积作为染色效果指数。另外，对阳性定位于细胞膜的免疫组化进行切片，其中的染色效果参照文献[2]标准判定，同样的以符号±，+，++，+++，++++进行评价，并且相应的评价分为1，2，3，4，5分，将两种分数的乘积作为染色效果指数。

1.4 统计学分析 基于统计软件SPSS13.0进行数字统计处理。在进行统计中，进行随机区间设计的秩和检验，并将检验结果在P

2 结 果

2.1 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，CK7的表现结果如下：在乳癌组织中，CK7的阳性显示为黄褐色的颗粒，其定位于细胞浆中，在总共26例标本中立即固定组均阳性。并且，在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数差异，有统计学意义（P

2.2 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，ER的表现结果如下：在乳癌组织，ER的阳性显示为黄褐色颗粒，其定位于细胞核中，在所有的标本中有22例立即固定组标本呈现出了阳性。在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数之间的差异P

2.3 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，C-erbB-2的表现结果如下：在乳癌组织，C-erbB-2阳性显示为黄褐色颗粒，并且阳性定位在细胞膜中，在所有的标本中有18例立即固定组标本呈现阳性。在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数之间的差异P

3 讨 论

由组织病理学基本理论可知，无论在组织切片活着进行电镜大体标本的保存，应该及时适当进行有效的固定。通过这种操作，才能达到使组织和细胞内蛋白凝固并能够在特定位置保留，进而可以防止破坏及自溶内外源性酶，从而最大程度的对组织和细胞的固有形态、结构实施了保护。当出现组织内没未能进行有效的固定时，内外源性酶将能够造成组织细胞结构破坏，甚至使某些特定部位的蛋白向周围扩散并出现降解。在本实验中，通过采用不同抗原修复液，并采用在延迟时间不等的固定组织，进行特定部位的蛋白免疫组化检测，在结果中可以看到特定阳性部位周围有不同的化程度的阳性背景。并且，在进行CK7免疫标记时，癌巢周围阳性背景随着抗原修复液A到F，固定时间的增长而逐渐加深；在进行ER免疫标记过程中，在核阳性减弱的同时出现胞浆的阳性背景；在进行C-erbB-2免疫标记过程中，胞膜阳性同时胞膜两侧均出现阳性背景。并且，从统计学角度，在CK7、ER和C-erbB-2在4组固定时间不等的乳癌组织间的表达效果具有统计意义。

免疫组织化学技术基本原理：基于抗原抗体反应或者组织化学的呈色反应，通过借助显色剂来标记特异性抗体在组织细胞原位，从而能够对相应抗原进行定性、定位和定量诊断。其中，组织固定不理想对于免疫组化染色结果有非常大的关系，其固定的结果程度和抗原保存有直接关系，因此应该进行尽快组织固定。在进行大标本和有包膜的标本实验时，由文献[3，4]应该进行切开固定。在其中的组织细胞不能及时有效固定，就会导致细胞内蛋白破坏降解，甚至导致免疫组化检测失败[5，6]。免疫组化染色中，组织结构的保存和抗原性等的改变程度有多方面的影响因素，主要包括：温度、抗原、固定液的pH值、固定剂种类、灌注速度和进行固定后处理方法等方面。

在本实验中，所选用得CK7、ER和C-erbB-2抗体，进行了在不同抗原修复液，在立即固定、延迟12小时固定、延迟24小时固定和延迟48小时固定的4组乳癌组织中，并且最终标记了细胞浆、细胞核和细胞膜等部位的相应蛋白。通过实验看出，在抗原修复液E和F及在延迟48小时中的不到明确的膜阳性。因此，延迟固定对膜蛋白免疫组化效果的影响更明显。延迟固定大幅弱化了免疫组化效果，其中的原因可能是延迟固定和内外源性蛋白酶对部分蛋白的降解，以及部分蛋白向周围扩散造成。抗原修复液E和F延迟固定太长，不太适宜进行检测，而抗原修复液A、B、C和D可以进行延迟固定组织免疫组化检测。可以得出，尽管在实验中免疫组化效果变差，但是可以分辨出特定部位的阳性结果。因此，对延迟固定组织只要充分固定和选用抗原修复液抗原修复液A、修复液B、修复液C和修复液D可以做免疫组化检测的，同时应注意减少实验延迟固定时间。

综上所述，对于那些客观因素造导致延迟固定标本，在其延迟时间未达到48小时之前，并且没有进行免疫组化辅助诊断，可以选用抗原修复液A、B、C和D进行免疫组化检测。应当注意的，判定检测结果应充分考虑到延迟固定带来的影响。因此，只要通过有效的措施排除了延迟固定产生的不良影响，免疫组化在一定意义上能够起到辅助诊断的作用。

参考文献

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[4] 杨红.免疫组化质量控制中的3个基本影响因素[J].临床与实验病理学杂志，2001，17（2）：183-185.

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[6] 杜宇，官大威，赵锐，等.抗原修复法和固定液pH 值对切创皮肤免疫组化染色的影响[J].中国法医学概论，2007，22（3）：156-159.