TIMP-1蛋白表达影响
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摘 要：目的：观察补肺汤对肺纤维化大鼠肺组织中基质金属蛋白-9（MMP-9）和组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（timp-1）蛋白表达及肺组织病理变化的影响。方法：雄性SD大鼠，随机分成4组：空白组、模型组、强的松组、补肺汤组。除空白组外，其余3组均采用博莱霉素（BLM）制作肺纤维化大鼠模型，每日灌胃给药，造模后7、14、28天取材。通过免疫组织化学染色方法，检测肺组织MMP-9、TIMP-1蛋白表达，采用光学显微镜观察肺组织病理变化。结果：与模型组比较，补肺汤组、强的松组各时间点肺泡炎和肺纤维化程度均较轻；与模型组比较，各时间点强的松组、补肺汤组肺组织MMP-9蛋白表达明显减低；与模型组比较，各时间点的强的松组、补肺汤组肺组织TIMP-1蛋白表达明显降低。结论：补肺汤能够抑制早期肺泡炎的发生，降低肺组织MMP-9与TIMP-1蛋白表达，纠正MMP-9/TIMP-1失衡，改善细胞外基质的异常代谢，从而抑制或延缓博莱霉素致大鼠肺纤维化的发生和发展。
关键词：肺纤维化;MMP-9;TIMP-1;补肺汤
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2673-07
Study on Effects of Bufei Decoction on MMP-9 and TIMP-1 in
Lung Tissue of Pulmonary Fibrosis Rats
ZHANG Hong,XIA Yongliang,YANG Junchao,SONG Kang
(The first clinical medical college of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)
Abstract:Objective:To observe dynamically the effects of polygonum cuspidate on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and platelet-derived growth factor (PDGF) in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of pulmonary fibrosis rats and the pathological changes of lung tissue.Methods:96 SD male rats were divided into four groups randomly including control group,model group,prednisone group and Bufei Decoction group(n=24).Except the normal control group, other 3 groups were all adopted bleomycin(BLM) to set up rat model with pulmonary fibrosis by intragastric administration every day, and the materials were draw 7,14,28 days after making models.The contents of MMP-9 and TIMP-1 of lung tissue were detected with with immunohistochemical staining method and the pathological changes of lung tissue were observed with optical microscope.Results:Compared with model group,the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis in Bufei Decoction and prednisone group was mild compared with model group, the expressions of MMP-9 and TIMP-1 were decreased significantly in Bufei Decoction and prednisone group.Conclusion:Bufei Decoction can decrease the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis decreased significantly in the dexamethasone group and Bufei Decoction could decrease the expressions of MMP-9 and TIMP-1 in lung tissue and reestablish the balance between MMP-9 and TIMP-1,then improve the abnormal metabolism of extracellular matrix,so that it could inhibit the formation of pulmonary fibrosis.
Key words:Pulmonary fibrosis;MMP-9;TIMP-1;Bufei Decoction
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收稿日期：2011-07-05
基金项目：浙江省教育厅资助项目（20070708）
作者简介：张弘（1968-），女，副主任中医师，硕士研究生导师，硕士，研究方向：中西医结合呼吸病的临床与科研。肺纤维化是由多种复查原因而引起的肺脏损伤。近年来，随着中医中药防治肺纤维化的研究逐渐深入，多项研究表明，中医药在防治肺纤维化中有着西药不可取代的作用，因此中医药研究成为关注的热点。本实验采用国际上通用的博莱霉素经气管滴注给药复制SD大鼠肺间质纤维化模型，应用补肺汤进行治疗，通过免疫组织化学染色方法，检测肺组织MMP-9、TIMP-1表达，从而进一步探讨补肺汤对肺纤维化的防治作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，96只 (由浙江中医药大学动物实验中心提供)。
1.1.2 实验药品及试剂 博莱霉素（BLM5），15mg/支，日本化药株式会社，批号：870690；强的松片，5mg×100片，西安利君沙制药股分有限公司，批号：20080110，经生理盐水稀释后配成浓度为0.63g/L混悬液；补肺汤流浸膏，由人参15g，黄芪30g，熟地黄20g，五味子6g，紫菀15g，桑白皮15g组成，浓度1g/mL，浙江省中医院制剂室提供；MMP-9、TIMP-1试剂盒EnVisionTM Two-Step Histostaining Reagent由丹麦DAKO公司的提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组及处理 清洁级雄性SD大鼠96只，随机分成四组，每组各24只：空白组正常喂养，每天给予生理盐水1mL/100g灌胃；模型组、补肺汤组、强的松组于博莱霉素造模后第2天始，分别给予生理盐水1mL/100g、1g/mL的补肺汤1mL/100g、0.63g/L的强的松混悬液0.63mg/100g灌胃，每日1次，直到处死时，分别于造模后第7、14、28天每组各处死8只大鼠。
1.2.2 造模方法 主要参考文献报道\[1\]。
1.2.3 标本收集 各组予造模后第7、14、21天分别处死8只大鼠，取肺组织。切取右肺在生理盐水中漂洗干净，取右肺中叶置于10%甲醛中固定，脱水、透明、浸蜡和包埋等制作成石蜡组织块和切片，测定MMP-9、TIMP-1；行HE和MASSON染色，观察肺泡炎分度和肺纤维化分级。
1.2.4 标本检测
（1）光学显微镜观察肺组织结构变化：石蜡切片的HE染色（苏木素-伊红染色）；石蜡切片的Masson染色。
（2）病理形态学定量分析 组织病理学的病变程度：根据Szapiel等\[2\]的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度，并参照张动伟等提供的标准将肺泡炎和肺纤维化分级并计算积分，进行病理半定量分析。具体标准见表1。
（3）免疫组化 MMP9和TIMP1的测量
使用HPIAS-1000病理图文分析系统对免疫组化的表达采用定量检测分析的方法：每张切片随机采集2视野（×200倍）测量其阳性细胞的平均光密度，经过该系统自动分析获得肺组织该视野的平均光密度值，经平均后代表该标本的染色强度，然后进行整理及统计分析（测量具体过程同MASSON染色定量过程）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0统计软件包进行统计，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析（one way ANOVA）。以P＜0.05为有显著差异，以P＜0.01为有非常显著差异。
2 结 果
2.1 HE染色
病理显示（见图1）：空白组在各时间点未见明显病理改变。模型组第7天时间点主要是以巨噬细胞、淋巴细胞为主的大量的炎性细胞浸润，伴有肺泡隔增宽；第14天时间点较7天时间点肺泡炎加重，肺纤维化增加；第28天时间点见少量的炎性细胞浸润，肺组织结构破坏，肺泡腔明显缩小，肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代，肺间质纤维化形成。补肺汤组、强的松组在第7天时间点肺内主要表现为炎性细胞浸润，有中量炎性细胞浸润，主要呈轻中度肺泡炎改变；第14天时间点与28天时间点可见肺纤维化程度增加，但较模型组程度轻。
由表2、图1可知：模型组、强的松组、补肺汤组在第7、14、28天时间点与空白组比较，肺泡炎和肺纤维化程度均较重，有非常显著差异（P＜0.01），但补肺汤组和强的松组随时间推移与空白组差异逐渐缩小。补肺汤组、强的松组在第7、14、28天时间点与模型组比较，肺泡炎和肺纤维化程度均较轻，有显著差异（P＜0.05）。随时间推移补肺汤组与强的松组肺泡炎和肺纤维化程度逐渐减轻，但两组间比较无明显差异（P＞0.05）。
2.2 Masson染色
在MASSON染色切片中（见图2），细胞核呈蓝褐色，胶原纤维呈绿色，肌纤维、红细胞和纤维素呈红色。在空白组呈蓝色的胶原纤维主要分布在血管、气管的基底膜和他们的周围；而在模型组弥漫性的表达增加，特别是第28天，肺泡壁增厚呈弥漫性，部分融合成大泡；强的松组及补肺汤组随时间推移，片中呈蓝色的胶原纤维逐渐增多，但增加的速度明显较模型组为慢，局部肺泡壁增厚，病变范围呈局限性，伴少许大泡。
由表3、图2可知：在第7天时间点，各组MASSON染色像素阳性百分比模型组、补肺汤组及强的松组较高，但与空白组比较无明显差异（P＞0.05）；第14、28天时间点，模型组、补肺汤组及强的松组MASSON染色像素阳性百分比较正常组明显升高，有非常显著差异（P＜0.01）。在第7天时间点，补肺汤组、强的松组与模型组比较，MASSON染色像素阳性百分比无明显差异（P＞0.05）；在第14、28天时间点，补肺汤组、强的松组MASSON染色像素阳性百分比较模型组减少，结果有显著差异（P＜0.05）。各时间点补肺汤组与强的松组MASSON染色像素阳性百分比均无明显差异（P＞0.05）。
2.3 肺组织MMP-9蛋白表达变化
由表5、图4可见：除空白组外，各组大鼠肺组织TIMP-1蛋白表达量在造模后随着时间的推移逐渐增多。与空白组比较，在第7、14、28天各时间点的模型组、补肺汤组、强的松组肺组织TIMP-1蛋白表达均明显增高，有显著差异或非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，在第7、14、28天各时间点的强的松组、补肺汤组肺组织TIMP-1蛋白表达明显降低，有显著差异或非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01）。在第7、14、28天各时间点的强的松组TIMP-1蛋白表达与补肺汤组未见明显差异（P＞005）。
3 讨 论
肺间质纤维化的病理实质早期表现为肺泡炎症，晚期表现为肺泡上皮修复紊乱，纤维母细胞增生以及胶原等细胞外基质（ECM）成分过度沉积，肺泡正常的结构消失。肺泡炎程度愈重，肺损伤及纤维化愈重。因此，肺部病理形态的改变是最直观的疗效评价标准。本实验结果表明，正常组在各时期（第7、14、28天）未见明显病变；模型组第7天时，肺组织主要是以巨噬细胞、淋巴细胞为主的大量的炎性细胞浸润，伴有肺泡隔增宽；在第14天时较第7天时肺泡炎加重，肺纤维化增加；第28天时，肺组织见少量的炎性细胞浸润，肺组织结构破坏，肺泡腔明显缩小，肺间质被胶原纤维和成纤维细胞替代，肺间质纤维化形成。与正常组比较，模型组大鼠在整个实验过程中肺泡炎和纤维化程度均较重（P＜0.01），同时病理积分（MASSON像素点阳性百分比）显示，模型组在7天时肺纤维化积分不明显，在14、28天时均明显高于正常组(P＜0.01)，并且模型组不同时期的组间比较发现肺纤维化积分进行性增高（P＜0.01），说明造模后随着时间的推移，大鼠肺纤维化程度逐渐形成并加重。与模型组比较，补肺汤组大鼠的肺泡炎和肺纤维化程度要低于模型组，在第14、28天时其肺纤维化积分均明显低于模型组（P＜0.05），而与强的松组相比尚无统计学意义。因此，补肺汤可以减少肺间质细胞内胶原和基底膜的破坏，能够延缓和减少肺纤维化的产生，对肺纤维化形成有积极的干预作用。
肺纤维化的主要病理表现为成纤维细胞异常增殖和ECM过度沉积。有研究结果表明，ECM蛋白降解酶活性受到抑制是引起ECM成分在组织内过度沉积，从而导致肺纤维化的重要机制。正常状况下，肺内ECM的合成和降解处于动态平衡，有研究发现MMPs /TIMPs在ECM调节中起重要作用。TIMPs是MMPs功能的重要调节因素，其作用主要是抑制MMPs对ECM的降解。MMPs /TIMPs间的失衡导致ECM的代谢失衡\[3\]。MMP-9属于明胶酶B，可降解明胶蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白及胶原蛋白。TIMP-1在组织异性抑制MMP-9，能抑制ECM的降解。TIMP-1不仅可能在肺纤维化形成阶段通过抑制细胞外基质的降解对肺纤维化的形成起作用，而且可能以与MMPs不同的方式参与了肺泡炎症的过程。李圣青等\[4\]发现MMP-9和TIMP-1与肺纤维化关系密切，在肺纤维化后期MMP-9水平下降，TIMP-1上升，此时肺部主要为纤维增生样改变，表现为肺泡壁成纤维细胞的增生，Ⅱ型上皮细胞增生，伴大量胶原沉积，肺组织呈蜂窝状，局部肺实变。因此研究MMP-9/TIMP-1的相互作用关系对肺纤维化的发病机制和治疗有实际应用价值。
本实验研究表明，经博莱霉素气管滴注复制肺纤维化大鼠模型后，与空白组比较，模型组大鼠在第7、14、28天时间点，大鼠肺组织MMP-9与TIMP-1蛋白表达均明显增高，与空白组相比有显著差异或非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01），表明MMP-9与TIMP-1蛋白的表达在肺纤维化的整个形成过程中均有高表达。另外，随着时间的推移，第14、28天时间点MMP-9蛋白的表达呈下降趋势，说明基质金属蛋白酶活性与肺泡炎免疫反应密切相关，随着肺泡炎的减轻基质金属蛋白酶活性有所下降；而TIMP-1蛋白表达与MMP-9相反，随时间推移在不断的加强。我们从而推断这与肺纤维化形成过程有密切关系，肺纤维化早期以肺泡内炎症为主，肺内大量炎症细胞聚集，这些细胞释放一系列细胞因子、生长因子及炎症介质等，促进MMP-9的合成与活化；随着肺纤维化的形成，炎症细胞的分泌不断减少，从而导致MMP-9的合成与活化减少。与此同时，在肺纤维化早期的肺泡炎症期，随着MMP-9蛋白表达的升高，TIMP-1的表达也随之升高，使MMP-9 /TIMP-1比例仍能维持平衡，这可能是炎症早期未出现ECM积聚的重要原因之一；而随着MMP-9蛋白表达的降低，TIMP-1的表达升高，MMP-9 /TIMP-1比例失去了平衡，ECM的降解减少，从而导致了肺纤维化的发生。与模型组比较，补肺汤组在第7、14、28天各时间点大鼠肺组织MMP-9蛋白表达均明显降低，有显著差异或非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01）；TIMP-1的表达与模型组比较也明显降低，有显著差异或非常显著差异（P＜0.05或P＜0.01），表明补肺汤对大鼠肺组织MMP-9与TIMP-1蛋白表达均有明显的抑制作用，从而延缓了肺纤维化的发生与发展。这种抑制作用虽较强的松组低，但与强的松组比较没有明显差异。
综上所述，补肺汤能够抑制肺纤维化大鼠肺组织的炎症及病理程度，抑制肺组织中MMP-9与TIMP-1蛋白表达水平，从而发挥其抑制或延缓肺纤维化的作用。
参考文献
［1］ 宋康，骆仙芳，石亚杰等．虎杖对肺纤维化大鼠Th1/Th2细胞因子干预作用的实验研究\[J\]．中华中医药杂志，2007，21（12）：781-783．
［2］ Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse\[J\].Am Rev Respir Dis，1979，120(4):893-897.
［3］ Oggionni T,Morbini P,Inghilleri S,et al.Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin induced pulmonary fibrosis\[J\].Eur J Histochem,2006,50(4):317-325.
［4］ 李圣青,张艰,黎志东,等.小鼠肺纤维化模型中基质金属蛋白酶-9及其抑制剂表达水平的变化\[J\].细胞与分子免疫学杂志,2004,20（6）:723－726.
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图2 Masson染色
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