痰热清注射液抑制HepG2细胞的研究

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[摘要] 目的 研究痰热清注射液对HepG2肝癌细胞株的抑制及对细胞周期的影响。 方法 采用MTT法检测痰热清注射液对hepg2肝癌细胞株的抑制，采用凯基细胞周期法检测该药对细胞周期的影响。 结果 痰热清注射液呈剂量依赖性抑制HepG2细胞，使细胞阻滞于G0/G1期，细胞DNA合成减少。 结论 痰热清注射液对肝癌细胞具有一定抑制作用，可能与使细胞阻滞于休眠期或DNA合成前期，导致细胞DNA合成减少有关。

[关键词] 痰热清注射液；HepG2细胞株；细胞周期

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（c）-0016-03

痰热清注射液属国家新药中药二类，方中以黄芩为君药，熊胆粉、山羊角为臣药，金银花为佐药，连翘为使药[1]，具有清热、解毒、化痰等功效，主治急性支气管炎、急性肺炎（早期）出现的痰热阻肺症状，但其主要药物如黄芩、熊胆粉、山羊角俱为归于肝胆经的药物，其中，绿原酸对肝癌还具有显著的抑制作用[2]，但未见痰热清复方注射液用于治疗肝癌的相关文献报道。中山大学附属第三医院临床采用痰热清注射液治疗中医证型辨证为肝胆湿热的肝炎、肝硬化和肝癌在内的多种肝脏疾病，结果显示可减少肝癌介入栓塞术后综合征，如发热、腹痛、呕吐等症状[3]。本研究初步观察了痰热清注射液对肝癌细胞株HepG2生长及细胞周期的影响，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM 培养基（GIBCO公司）， MTT（Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青公司），96孔、6孔培养板及25 cm2培养瓶（COSTER公司），酶标仪（BIO-RAD、Model450 MICRoPLATE READER），痰热清注射液由上海凯宝药业有限公司生产，批准文号：国药准字Z20030054 。

1.2 细胞抑制率检测

采用MTT法。

1.2.1 细胞培养及药物浓度设定 收集复苏后培养传代5代以内对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板中每孔加入200 μL铺板，使待测细胞密度调至5000个/孔。细胞生长48 h后，根据多次预实验结果，将痰热清注射液按原药物浓度用DMEM倍比稀释成8个浓度梯度：40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/L，并设空白对照组，每组设4个复孔，实验重复3次。

1.2.2 细胞抑制率测定 加入药物后培养48 h，先弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），加培养液继续培养4 h后吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪OD 490 nm 处测量各孔的吸光值。检测时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）、对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），并另设不加MTT的对照孔（即细胞、相同浓度的药物、培养液、二甲基亚砜），实验孔吸光值减去不加MTT的对照孔值为矫正后的实验孔值。细胞抑制百分率（%）=（细胞对照组平均A值-实验组平均A值）/细胞对照组平均A值×100%；细胞半数有毒浓度（TC50）=antilog[B+（50-B）/（A-B）×C]；A=log（>50%药物含量）；B=log（

1.3 细胞周期检测

采用凯基细胞DNA含量（细胞周期）即时检测试剂盒。

1.3.1 细胞培养及分组 将HepG2细胞铺于6孔板，细胞调密度至1×105/孔，采用DMEM混合培养液（含10%胎牛血清 ），置5%CO2培养箱中37℃培养，48 h后按照TC50加入浓度分别为2.5、1.25、0.625 mg/L的痰热清注射液，并加培养液至2 mL，再培养48 h后收集细胞行流式细胞仪检测，每组3个复孔，同时设立空白对照组。

1.3.2 细胞周期检测 收集106个细胞，用1 mL PBS重新悬浮，离心后弃上清；加入0.5 mL Solution Buffer悬浮细胞，离心弃上清；再加入0.5 mL Solution Buffer悬浮细胞，离心弃上清；加入250 μL Solution A，25℃孵育10 min；加入200 μL Solution B，25℃孵育10 min；最后加入200 μL Solution C，4℃避光10 min；上机检测，记录激发波长488 nm 处红色荧光。取各剂量组均数计算细胞增殖指数，细胞增殖指数=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用Probit分析计算TC50，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰热清注射液对HepG2细胞增殖的抑制情况

痰热清注射液对HepG2细胞增殖的抑制实验结果显示，不同浓度的痰热清对HepG2细胞均有不同程度的抑制作用，随着药物浓度增高，抑制作用逐渐增强。痰热清注射液对HepG2细胞的TC50为3.62 mg/L。痰热清注射液作用48 h后对HepG2细胞的生长抑制情况见图1。

2.2痰热清注射液对HepG2细胞周期的影响

结果显示，2.5 mg/L组痰热清注射液使细胞阻滞于G0/G1期，该期细胞比率明显高于其他组（P < 0.01），其他各组间G0/G1期细胞比率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；各组G2/M期细胞比率差异无统计学意义（P > 0.05）；2.5 mg/L组S期细胞比率明显低于其他组（P < 0.01），1.25 mg/L组S期细胞比率亦明显低于空白对照组（P < 0.05）；2.5 mg/L组细胞增殖指数明显低于其他组（P < 0.01）；各组细胞均未见明显的凋亡峰。见表1、图2。

3 讨论

痰热清注射液中4种主要成分为绿原酸、黄芩苷、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸，鹅去氧胆酸为需要限量的毒性成分[5]，前三者均具有利胆作用，且值得注意的是，这三种成分均有抑制肿瘤作用的报道。熊去氧胆酸对HepG2细胞株具有抑制作用，可促使其凋亡，阻滞细胞增殖周期于G0/G1期。动物实验结果显示，熊去氧胆酸可以预防实验大鼠肝癌的发生，明显减少大鼠肝癌结节的数量[6]。黄芩苷可抑制肝癌HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡，使多数细胞阻滞于S期[7]。痰热清注射液中绿原酸含量约为6.0 g/mL[8]，绿原酸可通过抑制细胞生长、调节细胞周期、诱导凋亡等途径产生抗癌作用[9]。在肝癌细胞系Hep3B中，绿原酸的半数有效抑制浓度（IC50）只需达到30～50 nmol/L即可产生良好的抗金属蛋白酶9（MMP-9）的功效，因此，其可能具有抑制肝癌转移的作用。甲基四氮盐实验研究表明， 绿原酸无细胞毒性[10]。动物实验显示，绿原酸可抑制化学物质对肝脏的致癌作用[11]。痰热清注射液含有上述三种具有抑癌作用的成分，但因痰热清注射液各批次成分含量差异[5]，因此，其抑癌作用结果需要多次重复实验。

本研究结果显示，痰热清注射液8个浓度梯度对肝癌细胞均有抑制作用，并随剂量的增加抑制作用增强，其机制可能与痰热清注射液将细胞阻滞于G0/G1期，致细胞DNA合成减少有关，前者与熊去氧胆酸作用类似，但用于细胞周期检测的3个浓度并未显示出促凋亡的作用，因此，需要进一步研究该复方注射液的抗癌机制。虽然痰热清导致细胞DNA合成减少，但已合成DNA的细胞仍可进入有丝分裂，导致各组细胞有丝分裂期的结果差异无统计学意义。

用于检测细胞增殖活力的CCK-8法较MTT法有突破性的改变，如MTT被还原成的甲臜需要二甲亚砜溶解，而CCK-8不需要加入后者；CCK-8中酚红和血清对测定无明显影响，不必去上清洗涤细胞，更加简便，也使结果数据更准确及稳定。但对于本身为棕红色透明液体的痰热清会影响吸光度值，即使不加MTT和细胞，也与实验孔的吸光度值相近，甚至高于实验孔。因此，本研究仍采用了MTT法检测细胞增殖情况，PBS冲洗细胞3次，并设计了矫正后的实验孔值以消除药物本身的影响。

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[9] 王丽萍，郭栋，王果，等.中药绿原酸的研究进展[J].时珍国医国药.2011，22（4）：961-963.

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（收稿日期：2013-01-08 本文编辑：程 铭）