HPLC法测定乐舒洗液中苦参碱和蛇床子素

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[摘要] 目的 建立高效液相色谱法同时测定乐舒洗液中苦参碱和蛇床子素的含量。 方法 采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）柱；流动相为：乙腈（A）-0.2%三乙胺（用磷酸调节pH至7.0）（B），以1.0 mL/min流速梯度洗脱同时测定两种成分含量；检测波长：220 nm（0～10 min）和320 nm（10～28 min）；柱温30℃。 结果 苦参碱浓度在225.0～1237.5 μg/mL范围内呈良好线性关系，A1 =17 737C1-55 443（r = 0.9998），蛇床子素浓度在0.6～36.8 μg/mL范围内线性关系良好，A2 = 87 876C2+12 670（r = 0.9999）。苦参碱和蛇床子素的平均回收率分别为100.4%和101.3%，RSD分别为2.8%和4.0%（n = 9）。 结论 本方法操作简单，结果准确，可用于乐舒洗液的质量控制。

[关键词] 乐舒洗液；高效液相色谱法；苦参碱；蛇床子素

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0126-03

乐舒洗液是广西柳州市妇幼保健院的传统制剂（批准文号：桂药制字Z02060005），其主要成分有蛇床子，苦参，黄柏，鹤虱，白鲜皮，百部，花椒等，具有抗菌，消炎，止痒，收敛，杀灭阴道滴虫等作用。方中蛇床子为君药，所含主要有效成分蛇床子素具有抗菌、止痒、抗变态反应、增强免疫力等作用[1-2]。原标准中无主要成分含量的测定项，为加强对该制剂的质量控制，保证制剂疗效，笔者在参考有关文献[3-12]的基础上，采用高效液相色谱法同时测定了制剂有效成分苦参碱和蛇床子素的含量。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统（LC-20AT泵，Rheodyne 7725i型进样阀，SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，DGu-20A在线脱气机，日本岛津），PHS-3C型PH计（上海精密科学仪器有限公司），KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超生仪器有限公司），HANGPINGFA1004型电子天平（上海天平仪器厂）。

苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110 805-200508），蛇床子素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110822-200305）。甲醇、乙腈为高效液相色谱纯试剂，水为重蒸馏水，其他使用试剂均为分析纯，乐舒洗液（柳州市妇幼保健院制剂室，批号：20120810、20120704、20120516、20110701、20110421）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）柱；柱温30℃；流动相为乙腈-0.2%三乙胺（磷酸调pH 7.0）梯度洗脱（0～5 min：28%乙腈，9～20 min：72%乙腈，23～28 min：28%乙腈）；流速1.0 mL/min；检测波长：220 nm（0～10 min）和320 nm（10～28 min）；进样量为20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取苦参碱对照品22.5 mg至容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得苦参碱对照品储备液。精密称取蛇床子素对照品18.4 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得蛇床子素对照品储备液。储备液置-20℃冰箱保存。临用前，精密取蛇床子素对照品储备液2.0 mL，加甲醇稀释并定容至10 mL，即得368.0 μg/mL的蛇床子素对照品工作液；精密取该蛇床子素稀释液1.0 mL，加甲醇稀释并定容至10 mL，即得36.8 μg/mL的蛇床子素对照品工作液。

2.2.2 供试品溶液 乐舒洗液超声30 min后，精密量取4 mL置10 mL具塞玻璃试管中，加0.5 mL浓氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振摇提取1 min，2000 r/min离心1 min，分取有机相至另一个10 mL离心管中置95℃水浴氮气吹干，共提取4次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至离心管中，涡旋溶解残渣，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 另按处方比例取缺苦参和缺蛇床子的药材，按照乐舒洗液制备工艺制备缺苦参和缺蛇床子阴性样品，再按供试品溶液制备方法操作即得缺苦参和缺蛇床子阴性样品溶液。

2.3 系统适应性

分别取阴性样品、混合对照品及供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图1），结果表明，供试品色谱中苦参碱和蛇床子素保留时间分别为7.6 min和19.9 min，与对照品溶液的保留时间一致；阴性样品在该色谱条件下对供试品测定无干扰，分离度良好。理论塔板数以苦参碱色谱峰计算应不低于3000，以蛇床子素峰计算应不低于30 000。

2.4 线性关系

精密吸取苦参对照品储备液、蛇床子素对照品工作液适量至同一容量瓶中，加甲醇定容至5.0 mL，配制成含苦参碱和蛇床子素分别为：1237.5和36.8、900.0和22.1、630.0和8.8、450.0和3.5、315.0和1.4、225.0和0.6 μg/mL的系列混合对照品溶液。分别进样20 μL，记录峰面积。以对照品浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线得苦参碱、蛇床子素的回归方程及相关系数分别为：A1=17 737C1-55 443，r = 0.9998；A2=87 876C2+12 670，r = 0.9999。结果表明，苦参碱和蛇床子素浓度分别在225.0～1237.5 μg/mL和0.6～36.8 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密取同一混合对照液连续进样6次，苦参碱和蛇床子素的RSD分别为1.0%（n = 6）和0.6%（n = 6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录峰面积。苦参碱和蛇床子素的RSD分别为1.1%（n = 6）和4.0%（n = 6），表明样品室温放置12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，进样测定含量。结果，苦参碱和蛇床子素的RSD分别为1.4%（n = 6）和2.4%（n = 6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密取4 mL已知含量的样品9份，分别置10 mL离心管中，分别加入一定量的苦参碱、蛇床子素对照液，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，依法测定。结果苦参碱和蛇床子素的平均回率分别为97.96%和101.31%，RSD分别为3.63%和4.02%，见表1、2。

3 讨论

在流动相的选择中，分别尝试用不同比例的乙腈-0.2%三乙胺做为流动相进行等梯度洗脱，结果表明，苦参碱和蛇床子素的极性差异较大，且该制剂杂质多，用等梯度流动相难以进行分离测定。曾采用甲醇-水系统作为流动相进行梯度洗脱，结果样品中苦参碱与其他杂质也不易分离[3]。对不同pH值的流动相进行了试验，结果表明：pH值对苦参碱色谱峰影响较大，pH值过低，苦参碱出峰过快；pH值过高，苦参碱色谱峰有拖尾现象；流动相pH为7.0时，分离效果最好。

文献方法检测苦参碱和蛇床子素分别采用220 nm[3-7]和320 nm[8-10]波长。试验表明：在320 nm波长下未能检测出苦参碱色谱峰；在220 nm波长下，蛇床子素色谱峰过小，与杂质未能完全分离，且基线漂移较大。改用220 nm和320 nm双波长检测，可同时完成对苦参碱和蛇床子素的分离测定。

在相同条件下比较了乙酸乙酯[10]、乙醚[11]以及乙酸乙酯-乙醚混合液（4∶1）等溶剂的提取效率，结果表明：乙酸乙酯对苦参碱的提取率最高，乙醚和乙酸乙酯对蛇床子素提取率相当；苦参碱的碱性较大，在加浓氨条件下提取率较高；苦参碱在水中溶解度较大，因而需用乙酸乙酯提取4次。本制剂中含有明矾，沉淀较多，超声后直接制成供试液进行测定，蛇床子素的回收率较低；滤除沉淀后制成供试液，蛇床子素的回收率才有较大的提高，表明沉淀对蛇床子素有较大的吸附作用。

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（收稿日期：2013-05-09 本文编辑：卫 轲）