油茶饼粕多糖对体外α葡萄糖苷酶的抑制作用

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摘 要：采用体外方法对从油茶饼粕中分离纯化后的油茶饼粕多糖的α葡萄糖苷酶的抑制活性进行了测试.结果表明：油茶饼粕多糖由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、甘露糖等构成，其相对分子质量为3 000～12 000；油茶饼粕粗多糖及各分级多糖的浓度与α葡萄糖苷酶的抑制活性呈现正相关，其IC50为0.053 mg/mL，油茶饼粕多糖具有抑制葡萄糖吸收的作用.

关键词：油茶饼粕多糖；α葡萄糖苷酶；活性抑制；体外

中图分类号：S789.9 文献标识码：AαGlucosidase Inhibitory Activity of Camellia

Cake Polysaccharides in Vitro

糖尿病的发生主要是因为血糖的来源与利用之间的动态平衡被破坏.多糖通过调节生物体内糖代谢酶来调节血糖水平，并通过抗氧化作用对血糖进行调节 [1-2].糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种综合病症.主要是由于体内胰岛素相对或绝对不足所引起的糖代谢紊乱所致.糖尿病患者长期处于高血糖状态会引起失明、肢体坏死等并发症[3].有研究表明茶多糖有较强的降血糖功能[4-5].而对油茶饼粕多糖在此方面的研究少有报道.

油茶饼粕多糖，是指山茶科山茶属油茶（Camellia oleifera Abel.）经过压榨制油后的种籽中所含的杂多糖类成分.油茶是我国特有的木本油料，据《全国油茶产业发展规划（2009-2020）》统计，我国现有油茶林面积302×104 hm2，年产油茶饼粕68.39万吨.油茶籽在榨油后形成的饼粕，通常用于提取茶皂素.而据报道，榨油后的油茶籽饼粕中化学成分组成是：脂肪8.73%，水分1.52%，粗蛋白5.85%，皂素30.34%，总糖50.52%，灰分2.95%[6].因此对糖类化学成分的研发对于延长油茶产业链、增加副产物的附加值具有重要意义.

湖南大学学报（自然科学版）2012年第11期李湘洲等：油茶饼粕多糖对体外α葡萄糖苷酶的抑制作用 由于天然α葡萄糖苷酶抑制剂在糖尿病饮食疗法中具有重要作用，因此研究天然α葡萄糖苷酶抑制剂的来源及应用十分必要[7].α葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型常用于降血糖药物的体外筛选 [8].α葡萄糖苷酶是一种存在于小肠黏膜细胞刷状缘的糖苷代谢酶，该酶针对双糖发挥水解作用，使进入小肠的碳水化合物最终形成单糖，被机体吸收.因此，通过观测α葡萄糖苷酶活性的变化情况，可获得药物抑制血糖的效果.与动物模型实验比较，这是一种操作性强且高效的实验方法.

本文研究油茶饼粕多糖对体外α葡萄糖苷酶抑制作用.首先测定了各分级多糖的相对分子质量.采取PMP柱前衍生高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成.然后通过测定底物（蔗糖）在α葡萄糖苷酶作用下生成葡萄糖量，计算样品对α葡萄糖苷酶的抑制率.

1 实验部分

1.1 实验材料

油茶饼粕：品种为普通油茶（Camellia oleifera），采集于湖南省株洲县，采集时间为2009年10月.经机械压榨后的干燥饼状物即为油茶饼粕.

12 试剂与仪器

葡萄糖试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号为112571；蔗糖：天津科密欧化学试剂有限公司，批号为1003042，用去离子水配制成30 mmol/mL作为底物溶液；阿卡波糖（Acarbose）：中国药品生物制品检定所，批号为1008082009202；PBS缓冲盐：天津津脉公司生产，出厂代码为JMF0006 ；生理盐水：湖南科伦制药有限公司生产，批号为091103503； DEAE52纤维素：北京瑞达恒辉科技发展有限公司；其他试剂为分析纯.

酶标仪：Thermo公司，型号Multiskan Ascent，96孔板；大鼠，SD雄性，体重230～270 g.

1.3 试验方法

1.3.1 油茶饼粕多糖的制备及相对分子质量测定

油茶饼粕多糖：油茶饼粕经脱脂、水提取、脱蛋白、乙醇沉淀后冻干获得油茶饼粕粗多糖（CCP）.粗多糖上DEAE52纤维素层析柱，先后采用去离子水，0.1 mol/mL， 0.2 mol/mL，0.5 mol/mL氯化钠溶液及0.5 mol/mL氢氧化钠溶液洗脱，分别收集洗脱液后减压浓缩，透析后冷冻干燥，获得分级多糖.以已知系列相对分子质量葡聚糖为对照品，采用高效凝胶色谱法（HPGPC）测定各分级多糖的相对分子质量.采取PMP柱前衍生高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成[9].

1.3.2 α葡萄糖苷酶抑制活性测定

α葡萄糖苷酶从大鼠肠黏膜内提取，于-20 ℃保存备用.实验分为空白组、不加抑制剂的阴性组、 阿卡波糖阳性对照组和待测样品组.酶液、阿卡波糖、油茶饼粕多糖样品分别用PBS缓冲液溶解稀释.在酶标仪96孔板中，依次加入如表1所示的各种试剂，经过酶液与反应底物剂量预试后，最终反应体积50 μL，置于37 ℃恒温箱保温20 min.

按葡萄糖试剂盒使用的要求，在50 μL测量液中再加入1 500 μL酚试剂（试剂盒自带），混合均匀，于37 ℃保温20 min，以空白管调零，在492 nm处测吸光值，吸光值与葡萄糖生成量呈线性相关. 根据测定结果计算IC50（即抑制酶活性达到50%时所需要抑制剂的浓度）.

抑制百分率IR=（A测试-A样品-A空白）/ （A测试-A空白） ×100 %.

表1 各实验组的溶液配制

Tab.1 Reagents in each experimental group μL

测试组空白组样品组阳性对照组缓冲液 12.525.000酶液25.025.025.025.0蔗糖溶液12.5012.512.5样品溶液0012.50阿卡波糖溶液00012.52 结果与讨论

2.1 多糖纯化与相对分子质量测试的结果

经过DEAE52纤维素柱层析对粗多糖样品的分离， 不同溶剂洗脱后获得的5个分级多糖.分别命名为CCP1， CCP2， CCP3， CCP4和CCP5.采用高效凝胶色谱法，以系列已知相对分子质量的葡聚糖为标准品，测定油茶饼粕多糖相对分子质量，结果见表2.