离体保存对野生毛葡萄试管苗生长及叶片抗氧化酶活性的影响
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摘 要： 【目的】为阐明缓慢生长法离体保存野生毛葡萄试管苗的机制，【方法】以野生毛葡萄‘花溪-9’为试材，利用缓慢生长法成功离体保存了供试材料试管苗，并从叶片解剖结构和生理生化变化2个方面阐述了毛葡萄试管苗离体保存存活率与叶片结构和抗氧化酶活性间的关系。【结果】温度、光照和烯效唑（S3307）对野生毛葡萄离体保存效果均有影响，其影响顺序为S3307>温度>光照，且3因素两两之间互作效应明显。野生毛葡萄在低温（10±2）℃、光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%琼脂粉的培养基上保存效果良好，存活率可达86.33%。离体保存存活率较高的试管苗叶绿素含量和膜质过氧化产物MDA含量较低，保护酶（SOD、CAT、POD）活性强，渗透调节物质可溶性蛋白含量高，叶肉细胞的紧密度提高，单位面积内细胞数量增多。【结论】适宜的离体保存方法增加了毛葡萄叶肉细胞的紧密度，提高了试管苗的抗氧化能力，这可能是缓慢生长法离体保存成功的重要机制之一。
关键词： 毛葡萄； 缓慢生长法； 生理响应； 结构变化； 种质保存
中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0615-06
种质资源是物种进化、遗传学研究及育种工作的物质基础，随着人类生产实践活动的不断深入和气候的异常变化，大量资源遭到了破坏，甚至灭绝，种质资源保护已成为一项世界性课题[1-5]。田间种植保存费用高，且仍面临着资源损失的危险；种子库保存则对有性繁殖困难的果树资源无能为力[5]。自离体保存策略[6-7]提出以来，该项技术受到了果树科学工作者的高度重视，已成功应用到多种果树种质资源的保存中[8-12]。目前关于果树种质资源离体保存研究主要集中在保存方法的探索、改良及遗传稳定性检测方面[12-18]，较少见到离体保存过程中保存材料的生理机制变化方面的研究，而探讨离体保存材料的生理变化机制与离体保存条件的关系，可深入了解离体保存的机制，有针对性地调整保存条件，增强方法探索中的针对性。本文以中国野生毛葡萄优株‘花溪-9’为试材，研究了不同离体保存条件下‘花溪-9’保存10个月后的相关形态和生理指标变化，并探讨了离体保存存活率和各项指标间的关系，以期探讨野生毛葡萄离体保存过程中生理响应机制，为野生毛葡萄离体保存提供科学的方法；并为探讨果树资源离体保存机制提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
以野生毛葡萄（Vitis heyneana Roem. & Schult ）优株‘花溪-9’离体快速繁殖的组培苗为试材。试验于2009—2010年在贵州省果树工程技术研究中心进行。
1.2 试验设计与离体保存保存方法
1.3 离体保存植株的生长及生理指标测定
1.4 叶片解剖结构观察
选取保存效果最好的叶片进行解剖结构观察，以T0为对照。剪取叶柄上方1 cm处长约5 mm叶片小块，立即放入FAA溶液中固定；采用常规制片法制片，在Olympus光学显微镜下观察，并用Motic Image Advances3.2软件采集图片并测量单位面积栅栏组织和海绵组织细胞个数。30次重复。
1.5 数据统计与分析
采用SAS分析软件进行多因素方差分析和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 离体保存对毛葡萄存活率及植株生长状况的影响
离体保存效果的好坏取决于离体保存时间的长短和保存存活率的高低。离体保存条件下，植株存活率高，生长相对缓慢，保存时间较长，则适合该物种离体保存。由表2可见，与对照相比，离体保存10个月后，毛葡萄的存活率不同程度的下降，但不同方法间差异很大，其存活率高低顺序为T1>T4>T2>T6>T7>T8>T5>T3>T9。结合植株生长情况来看（图版-T0～T9），在T1保存条件下，保存存活率最高，且植株生长相对缓慢，保存效果最优；其次是T2、T4和T7，但3者的长势略强；尽管T8的存活率略低，但在此条件下，毛葡萄生长较为缓慢，也可用于毛葡萄的离体保存。多因素分析表明，光照、温度及生长抑制剂S3307对野生毛葡萄存活率和生长势均有显著的影响，且不同的因素间互作效应显著；3个影响因素中S3307的影响最为明显，其次是温度，光照的影响相对较小（结果未列出）。
2.2.2 离体保存条件下毛葡萄叶片丙二醛含量变化 由图2可见，不同的离体保存条件下毛葡萄叶片内MDA含量差异很大。与对照相比，T1、T2、T8保存条件下，叶片MDA含量有所降低，而其他6个保存条件下叶片内MDA含量不同程度的上升，其中T3、T9条件下，叶片MDA含量升高幅度最大。尽管MDA含量高低与离体保存存活率并非一一对等关系，但是，存活率较高的保存方法，如T1，其叶片MDA含量较低；保存效果较差的方法，叶片MDA含量也较高，如T3、T9。
2.4 离体保存存活率与生理指标间的相关性分析
由表4可见，离体保存存活率与叶绿素含量和MDA含量呈负相关关系，但均未达到显著性水平，说明叶绿素、MDA含量较低的情况下，存活率有升高的趋势，但二者间相关性不强。存活率与叶片内保护性酶（SOD、POD、CAT）活性和可溶性蛋白质含量均呈显著正相关关系，说明叶片内保护酶活性越强，可溶性蛋白含量越高，存活率越高。而SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量两两之间均表现极显著正相关关系，叶绿素含量与SOD活性和可溶性蛋白含量显著负相关，表明离体保存条件下，毛葡萄叶片SOD、POD、CAT活性和可溶性蛋白含量4者之间高度正向协同变化。而绿叶素含量与SOD活性和可溶性蛋白含量则高度负协同变化。
3 讨 论
缓慢生长保存是一种中期保存方法，影响保存效果的因素很多，但主要是培养条件（光照和温度）和培养基组分[21-24]。本研究发现，在低温（10±2）℃和光照10 μmol·m-2·s-1（12 h·d-1）条件下，毛葡萄带顶芽的茎段接种到添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+ 3%蔗糖+0.5%琼脂粉的培养基上不需继代保存10个月，存活率可达86.33%。多因素分析表明光照、温度及生长抑制剂S3307对野生毛葡萄存活率和生长势均有显著的影响，这与前人的研究结果相一致[12，14-15，17]。不同的因素间互作效应显著，3个影响因素中S3307的效果最为明显，其次是温度，光照的影响相对较小。
离体保存过程中，低浓度（0.1 mg·L-1）植物生长延缓剂（烯效唑）可有效减缓毛葡萄试管苗生长，利于离体保存，而高浓度烯效唑（1.0～2.0 mg·L-1）对毛葡萄试管苗生长存在毒害作用，不利于离体保存，这与李朝周等[14]对葡萄栽培品种的保存浓度有所差异；低温条件下叶绿素和蛋白质合成代谢过程中部分酶活性受到一定程度的抑制，叶绿素和蛋白质合成速率降低，导致叶绿素含量的降低和生长速率的减缓；组培条件下，试管苗生长主要依靠异养条件，但自养能力同样存在，光照条件的减弱进一步抑制了试管苗的光合作用，从而进一步延缓了试管苗的生长，延长保存时间[17]，因此低温和弱光也是毛葡萄试管苗离体保存的可行途径。
对于果树种质资源离体保存研究多集中在保存方法的优化和遗传稳定性检测上[11-12，18]，果树种质保存过程中生理代谢及细胞组织结构变化方面的研究相对较少，也未见离体保存影响因素与生理指标的关系研究。本试验发现，与对照相比，离体保存10个月后的野生毛葡萄生理状态发生了改变，存活率较高的配方（如T1）下的试管苗叶绿素含量和膜质过氧化产物MDA含量较低，保护酶（SOD、CAT、POD）活性强，渗透调节物质可溶性蛋白含量高；反之，存活率较低的离体保存条件下（如T9）的试管苗叶绿素含量和MDA含量较高，保护酶活性弱，渗透调节物质可溶性蛋白含量低。
离体保存存活率与叶绿素含量、MDA含量呈负相关关系，但相关系数未达显著水平，而与保护酶活性和可溶性蛋白含量呈显著正相关关系。说明离体保存条件下，叶片生理状态影响离体保存效果，离体保存过程中，叶绿素含量的适度降低，可减弱光合代谢，利于离体保存；而保护酶活性和可溶性蛋白含量的升高，可有效抑制活性氧产生，使膜质过氧化产物MDA维持在较低的水平，从而提高了离体保存存活率。这与膜质过氧化水平低和保护酶活性高有利于种子保存的结论相一致[25-26]。本研究还发现离体保存条件下，试管苗叶肉细胞的紧密度发生了改变，单位面积内细胞数量增多，由此推断这种细胞结构上的变化可提高试管苗的抗逆性，利于离体保存。
本研究中仅研究了野生毛葡萄‘花溪-9’离体保存下的组织结构及生理响应，不同基因型果树离体保存条件差异很大，离体保存条件下其他果树的生理和形态响应机制需进一步探讨。
4 结 论
野生毛葡萄在低温（10±2）℃、光照10 μmol·m-2 ·s-1 （12 h·d-1）和添加0.1 mg·L-1 S3307的1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA+0.1 mg·L-1 IAA+3%蔗糖+0.5%琼脂粉的培养基上保存效果好，存活率可达86.33%。适宜的离体保存方法增加了野生毛葡萄叶肉细胞的紧密度，提高了试管苗的抗氧化能力，这可能是缓慢生长法离体保存成功的重要机制之一。（本文图版见封底）
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