α-玉米赤霉醇对体外培养成骨细胞增殖的影响

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【中图分类号】R96 【文献标识码】 A 【文章编号】1672-3873（2011）03-0002-02

【摘要】目的 观察α-ZAL对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的作用。方法 酶消化法分离培养SD乳鼠颅盖骨成骨细胞;应用MTT法测定成骨细胞增殖。结果 α-ZAL能促进大鼠颅骨成骨细胞增殖，最佳浓度为10-7mol/L和10-10mol/L。结论 α-ZAL可促进成骨细胞增殖和分化。

【关键词】α-玉米赤霉醇；细胞培养；成骨细胞

Effect of α-ZAL on osteoblasts cultured in vitro

Gao Wen,Duan Fei1, Li Shaochun , et al.

(College of Basic Medical Science of Hebei University，Baoding 071000，China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Effect of α-ZAL on osteoblasts cultured in vitro. Methods: Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn SD rats with enzymatic digestion method. The effect of α-ZAL on the proliferation of osteoblasts was determined by MTT assay. Result: α-ZAL increased osteoblastic proliferation at concentration of10-7mol/L, 10-10 mol/L. In this two concentration, they can inhibit osteoblast death.α-ZAL can promote the proliferation of osteoblasts.

[KEY WORDS] α-ZAL; cell culture; Osteoblast;

α-玉米赤霉醇（α-ZAL）是天然内源性植物激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的还原产物，属于二羟基苯酸内酯类化合物，具有促生长效应，与高等植物的发育有关，广泛存在于豆类、谷物等多种植物中[1]。α-ZAL结构与雌激素非常近似，初步的实验研究[2-3]发现，它具有与雌二醇类似的抗动脉粥样硬化及抑制组织因子分泌等作用，可产生心血管保护效应，同时对于由切除卵巢及由β淀粉样蛋白所致神经细胞损伤，对模拟阿尔茨海默氏病(AD)模型小鼠均有保护作用，作用与雌二醇相似。由于其结构与雌激素非常近似，其生物功能也同雌二醇相似，所以植物雌激素α-玉米赤霉醇可能对于绝经后骨质疏松症能产生雌激素样治疗作用。本研究将通过对体外成骨细胞的培养来探讨α-ZAL对成骨细胞增殖、分化以及凋亡等各方面的影响。

1实验材料与方法

1.1 试剂与药物17β雌二醇购自SIGMA公司、α玉米赤霉醇为DR. ehrenstorfer Gmbh 公司产、碱性磷酸酶测定试剂盒购自保定长城临床试剂有限公司，二甲基亚砜（DMSO）为AMRESCO公司产，胰蛋白酶为AMRESCO公司产、Ⅱ型胶原酶购自SIGMA公司。

1.2 动物SD孕鼠（河北医科大学动物中心提供）合格证编号：1004078

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠成骨细胞的分离培养

取一日龄SD大鼠十只，断颈椎处死后，放入75%的酒精中，10分钟，酒精中取出小鼠，取下头盖骨; 用PBS洗涤头盖骨两次;于青霉素小瓶内将头盖骨剪成泥状，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化20min后，用PBS洗涤，吹打沉淀，吸弃上清液;加入0.1%胶原酶37℃消化1h后，加细胞培养液，吹打均匀;重复一次，于离心机以1000rpm的速度，离心 15min ,使细胞沉淀，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养, 24 h后换液,以后隔日换液1次。培养至第4-7天,细胞长成致密单层,铺满培养瓶底,进行传代。

1.3.2成骨细胞鉴定:采用钙钴法碱性磷酸酶(ALP)染色进行成骨细胞鉴定。ALP阳性结果为成骨细胞胞浆呈灰黑色。

1.3.3 成骨细胞增殖活性检测（MTT法）将第3代成骨细胞传代接种于96孔板，细胞密度为5×104个/ml，以100μL /孔加入96孔板，细胞贴壁后，除去上清液，每孔分别加入α-ZAL终浓度各为10-5mol/L，10-6 mol/L，10-7 mol/L，10-8 mol/L，10-9 mol/L，10-10 mol/L，E2组浓度10-10 mol/L，阴性对照组（无水乙醇相应浓度），空白对照组，每组设4个复孔。α-ZAL，E2用无水乙醇溶解。培养20小时弃去上清液，每孔加入5mg/ml MTT液15μl，37℃孵育4小时后，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡5分钟，于酶标仪490nm处检测OD值。

2．结果

2.1 成骨细胞形态学观察及鉴定结果

刚接种的原代成骨细胞呈球形，24h内存活细胞已沉降贴壁，培养第2天完全展开，呈三角形、梭状形，核明显增大；传代培养5天，细胞形态可见多样化，胞浆丰富，向外伸展，伸出多个伪足，与周围细胞的伪足相互连结，细胞半融合；培养一周左右，可见长索性、多角形、条索形，汇合时细胞呈铺路石状，可重叠生长。ALP染色可见90%细胞染色阳性,胞质中出现灰黑色颗粒或块状沉，可证明为成骨细胞。

2.2 α-ZAL对成骨细胞增殖的影响与E2组比较，α-ZAL 10-7mol/L、α-ZAL 10-10mol/L这两种浓度差异无显著性（P>0.05），说明这两种浓度有促进成骨细胞增殖的作用，见表1。

3．讨论

成骨细胞是骨形成细胞,是骨形成和代谢的核心部分,对骨组织的生长发育和骨损伤的修复起关键作用[4]。这是因为成骨细胞中含有典型的高尔基复合体和丰富的粗面内质网，可以分泌骨基质蛋白混合物(类骨质),维持骨基质的沉积,控制骨吸收性的破骨细胞的分化和活动，从而抑制骨质疏松的发生[5]。成骨细胞功能减退导致新骨形成量减少，对骨吸收陷窝的修补能力减弱，造成骨小梁变细、薄弱、穿孔，皮质骨出现多孔性改变，从而引起骨质疏松症的发生，由于成骨能力下降而骨吸收加快是骨质疏松症的主要病理基础，因此提高成骨细胞功能对其治疗有直接意义[6]。

通过体外成骨细胞培养及其药物干预研究是寻找有效防治骨质疏松症药物的重要手段之一，这是因为体外成骨细胞培养可以排除体内实验复杂因子的相互干扰，可从单细胞形态及代谢指标的变化，反映某一影响因子的直接作用，研究单一因素对成骨细胞的调节作用，以阐明骨代谢调节的细胞分子机制，有助于确切了解药物的作用机制。另外许多实验证实,体外培养的成骨细胞具有与体内成骨细胞相同的生物学特性,能很好地反映成骨细胞的功能活动特点。

α-ZAL是天然内源性植物激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的还原产物，属于二羟基苯酸内酯类化合物，具有促生长效应，与高等植物的发育有关，广泛存在于豆类、谷物等多种植物中。本研究显示10-7mol/L、10-10mol/L的α-ZAL能够使离体培养的大鼠颅骨成骨细胞增殖，分化的作用。

参考文献：

[1] Wang Wen,Zhu Guang-jin. Comparision between phyoestrogen α-zearalanol and supplementary ectogenesis 17β-estradiol in the effect on coagulation and fibrnolysis in ovariectomized rats. Chinese Journal of Clinical Rehabilitation.2005,9(27):195-197.

[2] Duan Jin-hong,Dai Shun-ling, Fang Cindy X,et al.Phytoestrogenα-zearalanol antagonizes homocysteine-induced imbalance of nitric oxide/endothelin-1 and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells. Cell Biochemistry and biophysics,2006,45(2):137-145.

[3] 宋俏蔚，王香桂。植物雌激素防治围绝经期综合征的研究进展[J]，国外医学妇幼保健分册，2004，15，（6）：360-362

[4] 常德有，杨靖，董福慧.阿胶对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响[J]，中国老年学杂志，2009,29：3230-3232

[5] 邹宇云,韩博,王炼,刘钟杰. 杜仲水提液对大鼠成骨细胞增殖的影响. 中国兽医杂志, 2010,46(8)：75-76.

[6] 刘继平， 程. 中药促进成骨细胞功能和ALP活性影响研究的意义 陕西中医学院学报，2010，33(1)：7.

[7] 范婧蓉,韩博,李禹涛,等. 骨碎补水提液对大鼠成骨细胞的影响.中国兽医杂志，2009，45（2）：13-15.

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