PT95菌株和6株标准青霉菌株的亲缘关系分析

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摘要：目的分析pt95菌株和6株标准菌株的亲缘关系。方法用RAPD技术分析PT95菌株、4株PT95的突变株和6株标准菌株，并应用SPSS软件构建聚类图。结果PT95菌株均与汤姆青霉系的3种已知标准菌有一定的差异，根据聚类图可清楚地将PT95菌株与其它菌株分开。结论PT95菌株不同于任一汤姆青霉系的已知菌，可能是一新种。

关键词：青霉；DNA；扩增

中图分类号：Q935文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)06-0006-03

Genetic Relationship Analysis of Penicillium sp.PT95 and Six Standard Stains

CUI Li-xia1，HAN Jian-rong2

（1. College of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Taiyuan 030051, China; 2. School of Life Science and Technology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract：Objective To analyze the genetic relationship of Penicillium sp.PT95 and six standard stains. Methods Strains of Penicillium, i.e. PT95 and its 4 mutants as well as 6 standard strains had been analyzed by using RAPD, and the dendrogram was produced by SPSS. Results PT95 strain differed from all standard strains of P. thomii series. According to the dendrogram, PT95 strain could be obviously distinguished from other strains. ConclusionPT95 strain is not any species known of P. thomii series and probably is a new species.

Key words：Penicillium sp.; DNA; amplification

青霉PT95是一株能在菌核内积累类胡萝卜素的菌株，因它有单轮型帚状枝，已将其鉴定到汤姆青霉系（P. thomii series）[1]。本实验用随机扩增多态性DNA技术分析了PT95菌株和汤姆青霉系的几株标准菌株及其它青霉菌株之间的亲缘关系。

随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以PCR 为基础，利用人工合成的约10 bp的随机序列寡核苷酸作引物，以生物基因组DNA为模板进行PCR扩增产生不连续的DNA产物，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA序列多态性的一种技术。RAPD用于青霉的鉴定和多态性分析方面国内报道较少。吴易等[2]对12株马内菲青霉（P. marneffei）进行DNA指纹图谱分析，认为RAPD技术可用于马内菲青霉基因的分型；Geisen等[3]用不同的引物对P. roqueforti进行基因型分析，认为RAPD分析与生理生化分析的结果是一致的；Bogs 等[4]应用此技术分析产生赭曲霉素的P. verrucosum 和 P. nordicum ，发现聚类结果与产生的次生代谢物之间是互相联系的。由此认为对青霉进行RAPD分析是研究菌种亲缘关系的有效途径。

1仪器与材料

1.1仪器

DYY-Ⅲ5型稳压稳流电泳仪、DYCP-31DN型电泳槽（北京六一仪器厂）；MSE微型高速离心机（日本三洋公司）；SW-CJ-1F超净台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；HH-B11电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PCR仪（PTC-200）；凝胶成像系统（GDS：Bioimaging System，Gene，US）。

1.2材料

PCR引物（上海生工生物技术服务有限公司）；dNTP、Taq DNA聚合酶、琼脂糖（上海申友公司）； DNA Marker（片段长度分别为21227，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564，125 bp，华美生物工程公司）。

产黄青霉（P. chrysogenum，编号3.3871）、菌核青霉（P. sclerotirum，编号3.4032）、石状青霉（P. lapidosum，编号3.4353）、娄地青霉（P. roqueforti，编号3.745）、嗜松青霉（P. pinophilum，编号3.745）和汤姆青霉（P. thomii，编号3.827）（中国科学院微生物研究所）；青霉PT95菌株和诱变得到的4株突变菌株PT1，PT2，PT3，PT9（山西大学生命科学与技术学院微生物学实验室提供）。

2方法与结果

2.1DNA提取

将保存的菌种转接到铺有玻璃纸的查氏固体培养基上，25℃倒置培养 7~10 d，刮取菌体，立即冷冻干燥，保存于－20℃下备用。DNA提取参照文献[5]，在0.8%的琼脂糖胶上检测DNA的质量和浓度。

2.2随机扩增多态性DNA

2.2.1RAPD反应体系25 μL反应体积中含10×Taq 酶缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl22.5μL，25 mmol/L dNTP 0.2 μL，2 μmol/L引物 3 μL，1.5 U Taq酶。95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，35 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，循环44次，最后72 ℃延伸8 min。取10 μL扩增产物进行1.2％的琼脂糖胶电泳，观察拍照。

2.2.2筛选引物从70个10 bp引物中筛选出13个扩增出 DN段多态性较好的有效随机引物。编号和序列如下：S103：5’AGACGTCCAC3’；S105：5’AGTCGTCCCC3’；S106：5’ACGCATCGCA；S112：5’ACGCGCATGT3’；S115：5’AATGGCGCAG3’； S118：5’GAATCGGCCA3’；S1383：5’TTAGCGCCCC3’；S1397：5’GAGCCCGACT3’；S1398：5’TGGTCCAGCC3’；S1399：5’TGAGGGGTGT3’；S1403：5’TGGCGCACAC3’；S1409：5’GGGCGACTAC3’；S1414：5’AAGTGCGACC3’。

2.2.3RAPD多态性标记筛选出的13个引物用于所有供试材料基因组DNA样品的扩增。13个引物均能扩增出11株供试菌株清晰的谱带，见图1，且重复性好，每个引物对每种青霉扩增出的DNA条带不等，所有引物扩增的DNA多态性片段的长度范围绝大多数为0.1～2 kb。在13个引物的扩增图谱中，没有任何2个菌株拥有完全一致的DNA指纹图谱，表明RAPD对青霉菌具有极高的分辨率。

1. DNA Marker2. 菌株3.38713. 菌株3.40324. 菌株3.43535. 菌株3.50976. 菌株3.7457. 菌株3.8278. 菌株PT959. 菌株PT110. 菌株PT211. 菌株PT312. 菌株PT9

图1由引物s1403，s1398，s1414和s1409扩增的11株青霉菌株基因型的RAPD 电泳图谱

2.3扩增结果的数据处理

以Marker做标准相对分子质量标记，确定反应产物在琼脂糖胶上的相对位置，某一DN段在某样品中出现赋值“1”，不出现赋值“0”为依据。综合13个引物的扩增片段，采用欧氏距离中最短距离聚类法，用SPSS数据处理系统（10.0版）软件自动生成聚类图，见图2。

从总体上看，11株供试菌株基因型可分为两类，其中同是帚状枝单轮生的汤姆青霉系的全部菌株和未知菌归为一类，另一类为其它非单轮生的标准菌产黄青霉、娄地青霉和嗜松青霉。前者包括两个组，未知菌株先聚为一组，再与汤姆青霉系的标准菌株聚为一类。菌株PT95，PT1，PT2的菌落无差别，只是在菌核产量上不同；菌株PT3不产生菌核，显微观察表明与PT95，PT1，PT2无差别；菌株PT9为帚状单轮生，菌落特征与PT3相似。另一类为其它3株菌株，娄地青霉和产黄青霉的相似率较高，这与它们都具不对称帚状的形态特征一致。上述结果表明，菌株间形态表现越近，遗传距离越小，反之遗传距离增大。

2.4PT95菌株的分类地位

培养特征和显微特征表明，PT95菌株严格帚状单轮生，并在固态培养或者固态发酵条件下产生大量菌核，应属于青霉属汤姆青霉系（P.thomii series）。由聚类图可见，PT95菌株与汤姆青霉系3株标准菌石状青霉、菌核青霉和汤姆青霉先聚类在一起，表明它们的亲缘关系接近。因此，形态和分子生物学方法得出的结论是相同的。但PT95菌株在电泳图谱上与汤姆青霉系3种已知标准菌均有一定的差异，根据聚类图也可以清楚地将PT95菌株与其他菌株分开，表明PT95菌株不同于汤姆青霉系的任一已知菌，很可能是一新种。

3讨论

由电泳图可见，RAPD对青霉有很高的分辨率，PT95菌株不同于汤姆青霉系的任一菌株。目前发现的汤姆青霉系只有菌核青霉、汤姆青霉和石状青霉[6] 3种菌，经本实验可以认为，PT95菌株有可能是汤姆青霉系的一新种，对此需要从分子生物学做进一步分析确定。

本实验采用的几株突变株系通过诱变方法得到[7]，几株突变株均为帚状单轮生，其中PT3和PT95，PT1，PT2的DNA指纹图谱特别相似，不同之处在于PT3不产菌核，这可能是在诱变过程中PT3的代谢途径发生改变，抑制了菌核的产生。因此，PT3可以作为研究PT95菌株菌核分化机制的对照菌株。

参考文献

[1]韩建荣，王肖娟，原香娥. 青霉PT95菌株菌核内产生类胡萝卜素的研究[J]. 微生物学通报，1998，25（6）：319-321.

[2]吴易，曹存巍，李菊裳，等. 12株马内菲青霉随机扩增DNA多态性研究[J]. 中华皮肤科杂志，2002，35（5）：366-368.

[3]Geisen R, Cantor M D, Hansen T K, et al. Characterization of Penicillium roqueforti strains used as cheese starter cultures by RAPD typing[J]. J Food Microbiol, 2001, 65(3): 183-191.

[4]Bogs C, Battilani P, Geisen R. Development of a molecular detection and differentiation system for ochratoxin A producing Penicillium species and its application to analyse the occurrence of Penicillium nordicum in cured meats[J]. J Food Microbiol, 2006, 107(1): 39-47.

[5]崔丽霞，韩建荣. 青霉DNA提取方法的比较[J]. 山西大学学报，2004，27（2）：185-187.

[6]孟昭赫，张国柱，宋圃菊. 真菌毒素研究进展[M]. 北京：人民卫生出版社，1979，359-360.

[7]韩建荣，董仙芳. 激光诱变青霉PT95原生质体选育类胡萝卜素高产菌株[J]. 微生物学通报，2002，29（2）：31-34.